免疫组织化学注意事项

免疫组织化学注意事项

1、为达到免疫组织化学技术的要求，组织固定越新鲜越好。 2、组织脱水必须彻底干净。

3、切片必须完整、均匀、平展、无皱折。

4、切片的附贴必须牢固，必须使用合适的粘贴剂。新的载玻片，放于玻璃清洗液中浸泡4小时甚至过夜，然后取出，经自来水彻底冲洗后，浸入酒精中达2小时以上，取出擦干备用或烘干也可。然后再将载玻片浸入3－氨基－三乙氧基－硅烷（3－Aminopropyl triethoxy- silane）的稀释液（1：50用丙酮或无水乙醇稀释都可以）中硅化10分钟，后经无水乙醇洗2次，烘干即可使用。

5、切片必须烘烤附贴牢固，既要经得起抗原修复时高温的作用而不使轻易脱片，又不至于破坏抗原，切片在60℃的恒温干燥箱中烘烤2-5小时最为合适。

6、切片脱蜡必须干净，否则将会影响免疫组化染色的最后结果。

7、必须彻底抑制内源性过氧化物酶的活性，才能降低背景的染色。H2O2甲醇较适合于大多数的情况，因为除了H2O2外，甲醇对各种酶，都有钝化的作用，因此H2O2甲醇的双重作用效果较好。

8、抗体的加入须注意的问题：①当PBS冲洗完毕后，在加入抗体，如一抗，

二抗或三抗。必须将存留于切片上的多余的PBS摔干，但不能让切片干涸，切片干涸，往往可产生非特异性染色，切片上PBS存留过多，将会稀释加入的抗体，影响加入抗体的浓度，同时也将影响最后的结果，如假阴性等。②加入的抗体以一滴为佳。当擦干组织块周边多余的PBS后，切片保持着一定的湿润度，此时加入另外的抗体为最佳时候，滴入抗体以一滴50μl为好，加入后，轻微地摇匀地覆盖于切片上，使最后的结果稳定均衡，不至于有的地方有反应，有的地方无反应。③切片没擦好将会影响加入抗体的质量。当加入抗体后，它可缩于切片的一边，此时你为了使加入的抗体能够完全地覆盖整个切片，便会使劲地加入抗体，此时的结果是，抗体依然滑向一边，或者完全露出，这不光没达到目的，还浪费抗体，正确的做法就是彻底地用PBS冲洗，摔干切片擦干切片周边的PBS，再滴入一滴抗体轻轻摇匀即可。