(KJ201705)水产品中硝基呋喃类代谢物的快速检测胶体金免疫层析法

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水产品中硝基呋喃类代谢物的快速检测 胶体金免疫层析法（KJ201705）

1 范围

本方法规定了水产品中硝基呋喃类代谢物快速检测方法。 本方法适用鱼肉、虾肉、蟹肉等水产品中呋喃唑酮代谢物（AOZ）、呋喃它酮代谢物（AMOZ）、呋喃西林代谢物（SEM）、呋喃妥因代谢物（AHD）的快速测定。 2 原理

样品中硝基呋喃类代谢物经衍生处理后，其衍生物与胶体金标记的特异性抗体结合，抑制抗体和检测卡/试纸条中检测线（T线）上硝基呋喃类代谢物-BSA偶联物的免疫反应，从而导致检测线颜色深浅的变化。通过检测线与控制线（C线）颜色深浅比较，对样品中硝基呋喃类代谢物进行定性判定。 3 试剂和材料

除另有规定外，本方法所用试剂均为分析纯，水为GB/T6682规定的二级水。 3.1 试剂 3.1.1 盐酸。

3.1.2 三水合磷酸氢二钾。 3.1.3 氢氧化钠。 3.1.4 甲醇。 3.1.5 乙醇。 3.1.6 乙腈。 3.1.7 邻硝基苯甲醛。 3.1.8 三羟甲基氨基甲烷。 3.1.9 乙酸乙酯。 3.1.10 正己烷。

3.1.11 邻硝基苯甲醛溶液（10mmol/L）:准确称取0.150g邻硝基苯甲醛，用甲醇（3.1.4）溶解并定容至100mL。

3.1.12 磷酸氢二钾溶液（0.1mol/L）：准确称取22.822g三水合磷酸氢二钾（3.1.2），用水溶解并定容至1000mL。

3.1.13 氢氧化钠溶液（1mol/L）：准确称39.996g氢氧化钠（3.1.3），用水溶解并稀释至1000mL。 3.1.14 盐酸溶液（1mol/L）：取10mL盐酸（3.1.1）加入到110mL水中。

3.1.15 三羟甲基氨基甲烷溶液（10mmol/L）：准确称取1.211g三羟甲基氨基甲烷（3.1.8），溶于80mL水中，加入盐酸（约42mL）调pH至8.0后用水定容至1L。 3.2 参考物质

3.2.1 硝基呋喃类代谢物参考物质的中文名称、英文名称、CAS登录号、分子式、相对分子量见表1，纯度≥99%。

表1硝基呋喃类代谢物参考物质的中文名称、英文名称、CAS登录号、分子式、相对分子量

中文名称 英文名称 CAS登录号 分子式 相对分子量 3-氨基-2-恶唑烷酮 3-anmino-2-oxazolidinone,AOZ 5-morpholine-methyl-3-amino-2-oxazolidinone,AMOZ 1-Aminohydantoinhydrochloride,AHD semicarbazidhydrochloride,SEM 80-65-9 C3H6N2O2 102.09 5-甲基吗啉-3-氨基-2-唑烷基酮 1-氨基-2-乙内酰脲盐酸盐 氨基脲盐酸盐 注：或等同可溯源物质。

43056-63-9 C8H15N3O3 201.22 2827-56-7 C3H5N3O2·HCl NH2CONHNH2·HCl 151.55 563-41-7 111.53 3.3 标准溶液的配制

3.3.1 标准储备液：分别准确称取适量参考物质（精确至0.0001g），用乙腈溶解，配制成100mg/L

的标准储备液。-20℃冷冻避光保存，有效期12个月。

3.3.2 混合中间标准溶液：准确移取标准储备液（3.3.1）各1mL于100mL容量瓶中，用乙腈定容至刻度，配制成浓度为1mg/L的混合中间标准溶液。4℃冷藏避光保存，有效期3个月。 3.3.3 混合标准工作溶液：准确移取0.1mL混合中间标准溶液（3.3.2）于10mL容量瓶中，用乙腈定容至刻度，配制成浓度为0.01mg/L的混合标准工作溶液。4℃冷藏避光保存，有效期1个月。 3.4 材料

3.4.1 AOZ试剂盒（含胶体金试纸条或检测卡及配套的试剂）。 3.4.2 AMOZ试剂盒（含胶体金试纸条或检测卡及配套的试剂）。 3.4.3 SEM试剂盒（含胶体金试纸条或检测卡及配套的试剂）。 3.4.4 AHD试剂盒（含胶体金试纸条或检测卡及配套的试剂）。 3.4.5 固相萃取柱（强阴离子交换型）：规格1mL，填装量为60mg。 4 仪器和设备

4.1 电子天平：感量分别为0.1g和0.0001g。 4.2 均质器。

4.3 水浴箱。 4.4 离心机。

4.5 氮吹仪或空气吹干仪。

4.6 移液枪：10μL，100μL，1000μL，5000μL。 4.7 涡旋振荡仪。

4.8 胶体金读数仪（可选）。 4.9 固相萃取装置（可选）。

4.10 环境条件：温度15-35℃，湿度≤80%。 5 分析步骤 5.1 试样制备

按照方法要求，称取一定量具有代表性样品可食部分（注：甲壳类，试样制备时须去除头部），用于后续实验。 5.2 试样提取和净化

称取适量的匀浆样品（以试剂盒操作说明书要求来定，精确至0.01g）于50mL离心管。 5.2.1 方法一（液液萃取法）

称取2g±0.05g均质组织样品于50mL离心管中，依次加入4mL去离子水、5mL1mol/L盐酸（3.1.14）和0.2mL10mmol/L邻硝基苯甲醛溶液（3.1.11），充分振荡3min；将上述离心管在60℃水浴下孵育60min；依次加入5mL0.1mol/L磷酸氢二钾溶液（3.1.12），0.4mL1mol/L氢氧化钠溶液（3.1.13），乙酸乙酯6mL，充分混合3min，在室温（20—25℃）下4000r/min，离心5min；移取离心后的上层液体3mL于5mL离心管中，60℃下氮气/空气吹干；向吹干的离心管中加入2mL正己烷，振荡1min，然后加入0.5mL10mmol/L三羟甲基氨基甲烷溶液（3.1.15），充分混匀30s，室温下4000r/min，离心3min（或静置至明显分层）；下层溶液即为待测液。 5.2.2 方法二（固相萃取法）

称取6g±0.05g均质组织样品于50mL离心管中，依次加入4mL去离子水、5mL1mol/L盐酸（3.1.14）和0.2mL10mmol/L邻硝基苯甲醛溶液（3.1.11），充分振荡3min；将上述离心管在60℃水浴下孵育60min；依次加入5mL0.1mol/L磷酸氢二钾溶液（3.1.12），0.4mL1mol/L氢氧化钠溶液（3.1.13），乙酸乙酯6mL，充分混合3min，在室温（20—25℃）下4000r/min，离心5min；移取离心后的上层液体3mL于15mL离心管中，加入10mL10%乙酸乙酯-乙醇溶液，上下颠倒混合4—5次，4000r/min离心1min（底部会有部分沉淀）。连接好固相萃取装置，并在固相萃取柱（3.4.5）上方连接30mL注射器针筒，将上述上清液全部倒入30mL针筒中，用手缓慢推压注射器活塞，控制液体流速约1滴/秒，使注射器中的液体全部流过固相萃取柱，再重复推压注射器活塞2次，以尽可能将固相萃取柱中的溶液去除干净。将固相萃取柱下方的接液管更换为洁净的离心管，再向固相萃取柱中加1mL10mmol/L三羟甲基氨基甲烷溶液（3.1.15）。用手缓慢推压注射器活塞，控制液体流速约1滴/秒，使固相萃取柱中的液体全部流至离心管中后，离心管中的液体即为待测液。

5.3 测定步骤

5.3.1 试纸条与金标微孔测定步骤

吸取适量样品待测液于金标微孔中，抽吸5—10次混合均匀，室温（20—25℃）温育5min，将试纸条吸水海绵端垂直向下插入金标微孔中，温育3—6min，从微孔中取出试纸条，进行结果判定。

5.3.2 检测卡测定步骤

吸取适量样品待测液于检测卡的样品槽中，室温（20—25℃）温育5—10min，直接进行结果判定。 5.4 质控试验

每批样品应同时进行空白试验和加标质控试验。 5.4.1 空白试验

称取空白试样，按照5.2和5.3步骤与样品同法操作。 5.4.2 加标质控试验

准确称取空白样品适量（精确至0.01g）置于50mL具塞离心管中，加入适量硝基呋喃类代谢物标准工作液，使其浓度为0.5μg/kg，按照5.2和5.3步骤与样品同法操作。 6 结果判定要求

结果的判断也可使用胶体金读数仪判读，读数仪的具体操作与判读原则请参照读数仪的使用说明书。采用目视法对结果进行判读，目视判定示意图如图1和图2所示。 6.1 比色法 6.1.1 无效

控制线（C线）不显色，表明不正确操作或试纸条/检测卡无效。 6.1.2 阳性结果

检测线（T线）不显色或检测线（T线）颜色比控制线（C线）颜色浅，表明样品中硝基呋喃类代谢物高于方法检测限，判为阳性。 6.1.3 阴性结果

检测线（T线）颜色比控制线（C线）颜色深或者检测线（T线）颜色与控制线（C线）颜色相当，表明样品中硝基呋喃类代谢物低于方法检测限或无残留，判为阴性。