微生物检验操作指导书

化验室操作指导书（受控） 12 （四）食品平板菌落计数

1 主题内容与适用范围

本文规定了食品平板菌落计数的方法。

本文适用于航空配餐的各种半成品、成品及原料，有专门规定的检验方法的除外。 2 设备和材料

超净工作台、恒温培养箱（36±1℃）、均质器、振荡器、吸管（1ml、10ml）、平皿、稀释瓶、天平等 3 培养基和试剂

平板计数琼脂、75％乙醇、磷酸盐缓冲稀释液 4 操作程序 4.1 样品制备

4.1.1 以无菌操作取有代表性的样品盛于灭菌容器内。如有包装，则用75％乙醇在包装开口处擦拭后取样。 4.1.2 制备样品匀液

以无菌操作取25g样品，放入装有225ml稀释剂的灭菌均质杯内，于8000r/min均质1-2min，制成1：10的样品匀液。如样品均质时间超过2min，应在均质杯外加冰水冷却。 4.2 稀释样品匀液

4.2.1 用10ml灭菌吸管准确吸取1：10的样品匀液10ml，放入装有90ml稀释剂的150ml 稀释瓶中。迅速振摇，将样品混匀，制成1：100的样品匀液。振摇时，幅度为30cm，7s内振摇25次。从容器中吸取样品匀液和以后的稀释操作中，吸管尖不要碰着瓶口。吸入的液体应先高于所要求的刻度，然后提起吸管使其尖端离开液面并贴在容器内壁将液体调至所要求的刻度。 4.3 平板接种

4.3.1 对于每个样品，选用合适的三个连续稀释度的样品液进行平板计数。

修订 1 2011－08－18

化验室操作指导书（受控） 13 4.3.2 分别用灭菌吸管吸取1ml样品液放入作了适宜标志的平皿内。每个稀释度的样品液用两个平皿。

4.3.3 分别加12-15ml平板计数琼脂（约45℃左右）到平皿内。立即将平皿内的样品液和琼脂培养基充分混合。要防止把混合物溅到平皿壁和盖上。同时将平板计数琼脂倾入加有1ml稀释剂的另一灭菌平皿作空白对照。将样品液加入平皿后应立即倾注琼脂培养基，每个样品从开始稀释到倾注最后一个平皿所用的时间不得超过20min。 4.4 培养

待琼脂凝固后将平皿翻转，立即放进36±1℃的恒温培养箱培养48±2h。培养箱应保持一定的湿度，经48h培养的琼脂培养基的失重不得超过15％。 4.5 菌落计数和记录

4.5.1 培养后，立即计数每个平板上的菌落数。25-250个菌落为合适范围。如不能立即计数，应将平板存放于0-4℃，但不得超过24h。

4.5.2 操作者对同一平板复核自己的计数结果，其差异应在5％之内，而其他人对这一平板重复计数，其差异应在10％这内。否则，应找出原因，加以校正。 4.6 计算和记录数字

适宜稀释度的两个平板的菌落数平均值或两个稀释度的平板菌落数平均值乘以相应稀释度倍数计算出每克（毫升）样品中平板菌落数。

记录时，只有在换算到每克（毫升）样品中平板菌落数时，才能定下两位有效数字，第三位数字采用四舍五入的方法记录。也可将样品的平板菌落数记录为10的指数形式。 5 结果报告

报告每克（毫升）样品中平板菌落数或估计的平板菌落数。

注：本文参照SN0168-92《出口食品平板计数》

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化验室操作指导书（受控） 14 （五）食品中大肠菌群、粪大肠菌群和大肠杆菌检验方法

1 主题内容与适用范围

本文规定了食品中大肠菌群、粪大肠菌群和大肠杆菌检验方法。 本文适用于航空食品的检验。 2 设备和材料

吸管（1ml、10ml）、恒温培养箱（36±1℃、44.5±0.5℃）、冰箱、均质器、振荡器、平皿、稀释瓶、天平、显微镜等 3 培养基和试剂

月桂基硫酸盐胰蛋白月示（LST）肉汤、煌绿乳糖胆盐（BGLB）肉汤、EC肉汤、伊红美蓝琼脂（EMB）、营养琼脂斜面、色氨酸肉汤、MR-PV培养基、Korser氏枸掾酸盐肉汤、结晶紫中性红胆盐琼脂（VRBA）、Butterfield氏磷酸盐缓冲稀释液、生理盐水、革兰氏染色液、Kovacs氏靛基质试剂、甲基红指示剂、Voges-pros kauer（V-P）试剂、 4 样品制备

4.1 以无菌操作取有代表性的样品盛于灭菌容器内。如有包装，则用75％乙醇在包装开口处擦拭后取样。 4.2 制备样品匀液

以无菌操作取25g样品，放入装有225ml稀释剂的灭菌均质杯内，于8000r/min均质1-2min，制成1：10的样品匀液。如样品均质时间超过2min，应在均质杯外加冰水冷却。 4.3 稀释样品匀液

用10ml灭菌吸管准确吸取1：10的样品匀液10ml，放入装有90ml稀释剂的150ml 稀释瓶中。迅速振摇，将样品混匀，制成1：100的样品匀液。 5 大肠菌群的测定 5.1 大肠菌群MPN值的测定

5.1.1 对每个样品，选择适宜的三个连续稀释度的样品稀释液。每个稀释度接种三管月桂基

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化验室操作指导书（受控） 15 硫酸盐胰蛋白月示（LST）肉汤，每管接种1ml。 5.1.2 将接种管置于36±1℃的培养48±2h。

5.1.3 观察试管的产气情况：检查倒管内是否有气泡产生，记录在24h和48h内产气的LST肉汤管数。如所有LST肉汤管均未产气，则可报告为大肠菌群阴性；如有产气者，则进一步作证实试验。

5.2 大肠菌群的证实试验

5.2.1 将所有产气管用直径为3mm的接种环移种到煌绿乳糖胆盐（BGLB）肉汤管中。 5.2.2 置BGLB肉汤管于36±1℃的培养48±2h。 5.2.3 记录所有BGLB肉汤管的产气管数。

5.2.4 结果报告：按BGLB肉汤产气管数，查MPN表报告每克（毫升）样品中大肠菌群的MPN值。

6 粪大肠菌群测定

6.1 用接种环将所有48±2h内产气的LST肉汤管培养物移种于EC肉汤管中。

6.2 将所有接种的EC肉汤管在30min内放入44.5±0.5℃水浴箱内，培养24±2h。水浴箱的水平面应高于肉汤培养基液面。应以已知为44.5℃产气阳性的大肠杆菌和44.5℃不产气的产气肠杆菌或其他大肠菌群细菌作阳性和阴性对照。

6.3 记录EC肉汤管的产气情况。产气管为粪大肠菌群试验阳性；不产气管为粪大肠菌群试验阴性。

6.4 结果报告：按产气管数，查MPN表报告每克（毫升）样品中粪大肠菌群的MPN值。 7 大肠杆菌测定

7.1 将6.3条中的EC肉汤管继续培养24h取其产气管的培养物划线接种于伊红美蓝（EMB）平板，36±1℃的培养24±2h。

7.2 检查平板上有无具黑色中心有光泽或无光泽的典型菌落。

7.3 如有典型菌落，则从每个平板上至少挑取2个典型菌落；如无典型菌落，则从每个平板

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