HE染色方法与步骤吐血整理

HE染色

试剂配置

A：0.5~1%的伊红酒精溶液：

称取伊红Y0.5~1g，加少量蒸馏水溶解后，再滴加冰醋酸直至浆糊状。以滤纸过滤，将滤渣在烘箱中烤干后，以95%酒精（即工业酒精，如果不怕浪费，用无水乙醇配制也可）100毫升溶解。

B：苏木素染液配方：(配制3000ml，可按比列减少) 苏木精6g

无水乙醇100ml 硫酸铝钾150g 蒸馏水2000ml 碘酸钠1.2g 冰醋酸120ml 甘油900ml

配制方法：将苏木素溶于无水乙醇，再将硫酸铝钾溶于蒸馏水，溶解后将甘油倾入一起混合，最后加入冰醋酸和碘酸钠。

C：1%盐酸酒精分化液：将1毫升浓盐酸加入99毫升70%酒精中即可。

染色流程

(1)二甲苯（Ⅰ）15min (2)二甲苯（Ⅱ）15min

（3）二甲苯：无水乙醇=1:12min (4)100%乙醇（Ⅰ）5min (5)100%乙醇（Ⅱ）5min (6)80%乙醇5min (7)蒸馏水5min

(8)苏木精液染色5min

(9)流水稍洗去苏木精液1-3s (10)1%盐酸乙醇1-3s (11)稍水洗10-30s (12)蒸馏水过洗1-2s

(13)0.5%伊红液染色1-3min (14)蒸馏水稍洗1-2s (15)80%乙醇稍洗1-2s (16)95%乙醇（Ⅰ）2-3s (17)95%乙醇（Ⅱ）3-5s (18)无水乙醇5-10min (19)石炭酸二甲苯5-10min (20)二甲苯（Ⅰ）2min (21)二甲苯（Ⅱ）2min

(22)二甲苯（Ⅲ）2min (23)中性树胶封固

注：①第（11）、（12）步可省去，（13）步冲水时间需延长至20-30min。 ②第（21）步如果不用石炭酸二甲苯，可改用无水乙醇。 *冷冻切片HE染色步骤： （1）冰冻切片固定10～30s （2）稍水洗1～2s

（3）苏木精液染色（60℃）30～60s （4）流水洗去苏木精液5～10s （5）1%盐酸乙醇1～3s （6）稍水洗1～2s

（7）促蓝液返蓝5～10s （8）流水冲洗15～30s

（9）0.5%曙红液染色30～60s （10）蒸馏水稍洗1～2s （11）80%乙醇1～2s （12）95%乙醇1～2s （13）无水乙醇1～2s

（14）石炭酸二甲苯2～3s （15）二甲苯（Ⅰ）2～3s （16）二甲苯（Ⅱ）2～3s （17）中性树胶封固。

注：第（14）步如果不用石炭酸二甲苯，可改用无水乙醇。

染色结果：细胞核蓝色，胞质、肌纤维、胶原纤维和红细胞呈深浅不一的红色。

4．12切片脱水透明切片经HE染色后，要彻底脱水透明，才能用中性树胶封盖。如果脱水不彻底，封片后呈白色雾状，镜下观察模糊不清，且容易褪色。切片1-2级无水乙醇脱水，也可使用石碳酸二甲苯进行脱水。石碳酸有较强脱水能力，但长时间可使切片脱色，因此要经过多次二甲苯以使石碳酸完全除去。

5.H-E染色评定标准：

（1）切片完整，厚度4-6微米，厚薄均匀，无皱褶无刀痕；

（2）染色核浆分明，红蓝适度，透明洁净，封裱美观。

4 染色结果 编辑

细胞核被苏木精染成鲜明的蓝色，软骨基质、钙盐颗粒呈深蓝色，粘液呈灰蓝色。细胞浆被伊红染成深浅不同的粉红色至桃红色，胞浆内嗜酸性颗粒呈反光强的鲜红色。胶原纤维呈淡粉红色，弹力纤维呈亮粉红色，红血球呈橘红色，蛋白性液体呈粉红色。

着色情况与组织或细胞的种类有关，也随其生活周期及病理变化而改变。例如，很多细胞在新生时期胞浆对伊红着色较淡或轻度嗜碱，当其衰老时或发生退行性变则呈现嗜伊红浓染。胶原纤维在老化和出现透明变性时，伊红着色由浅变深。

Masson染色,用于显示组织中纤维的染色方法之一。

试剂：

Regaud 氏苏木精：苏木精1g，95%酒精10ml，甘油10ml，蒸馏水80ml。 将苏木精加入蒸馏水内加温溶解,冷却后加入酒精和甘油,放数日后即可应用。

Masson丽春红酸性复红液： 丽春红0.7g，酸性复红0.3g，蒸馏水99ml，冰醋酸1ml。 0.2%冰醋酸水溶液： 冰醋酸0.2 ml，蒸馏水100 ml。 1%磷钼酸水溶液：磷钼酸1g，蒸馏水100 ml。

苯胺蓝水溶液：苯胺蓝2g，蒸馏水98 ml，冰醋酸2 ml。 1%光绿水溶液：光绿 1g，蒸馏水100 ml。 Masson三色法步骤

1． 石蜡切片脱蜡至水。

2． 铬化处理或去汞盐沉淀（甲醛固定的组织此步可略）。 3． 依次自来水和蒸馏水洗。

4． 用Regaud苏木精染液或Weigert苏木精液染核5-10min。 5． 充分水洗,如过染可盐酸酒精分化。 6． 蒸馏水洗。

7． 用Masson 丽春红酸性复红液5-10min。 8． 以2%冰醋酸水溶液浸洗片刻。 9． 1%磷钼酸水溶液分化3-5min。

10. 不经水洗,直接用苯胺蓝或光绿液染5min。 11．以0.2%冰醋酸水溶液浸洗片刻。

12．95%酒精、无水酒精、二甲苯透明、中性树胶封固。

结果：胶原纤维、粘液、软骨呈蓝色（如光绿液染色为绿色），胞浆、肌肉、纤维素、神经胶质呈红色，胞核黑蓝色。 体会与说明：

1．控制好染色步骤。

2．组织固定起着很重要的作用，根据不同的固定液可延长或缩短染色时间。 3．0.2%冰醋酸水溶液洗，可使色调清晰鲜艳。

4．磷钼酸水溶液对丽春红、酸性复红有分化作用，分化时镜下控制， 肌纤维和纤维素呈红色，胶原纤维呈淡粉红色即可。

天狼猩红染色

[试剂配制]

(1)天狼星红饱和苦昧酸液 O．5％天狼星红10ml，苦味酸饱和液90ml。

(2)天青石蓝液 天青石蓝B1．25g．铁明矾1．25g，蒸馏水250ml。溶解煮沸、待冷却过滤 加入甘油30ml，然后再加入浓盐酸0．5ml。

[染色步骤]

(1)中性甲醛液固定组织，石蜡切片，常规脱蜡至水。 (2)人大青石蓝液染5一lOmin。 (3)蒸馏水洗3次。

(4)天狼星红饱和苦昧酸浓染15-30min (5)无水乙醇直接分化与脱水。

Devil二甲苯透明，中性树胶封固。 [注意事项]

(1)细胞核里染色可以用Harris苏木素染色液谈染。

(2)染色封固后的切片，须及时用偏光显微镜进行观察和照相已保持鲜艳的色彩 注：在偏光显微镜下可以观察到四种类型的胶原纤维。

l型胶原纤维：紧密排列，显示很强的双折光性，呈黄色或红色的纤维o ll型胶原纤维：显示弱的双折光，呈多种色彩的疏松网状分布。 皿型胶原纤维：显示弱的双折光，呈绿色的细纤维。 lv型胶原纤维：显示弱的双折光的基膜，呈淡黄色。

免疫组化步骤（ABC法）

1。4%多聚甲醛常规灌注固定，取材并置20%蔗糖溶液（4℃）中过夜。蜡块制作。切片，贴片。0.01MKPBS清洗5min×3后；

2。加入配好的0.3%的过氧化氢甲醇溶液（甲醇80ml＋0.01MKPBS 100ml＋30%过氧化氢）30min，以消除内源性过氧化物酶的影响，0.01MPBS清洗5min×3；

3。加入配好的0.3% Triton X100（30% Triton X100＋0.01MKPBS 100ml）30min，以增加细胞的通透性，0.01MKPBS清洗5min×3； 4。加入用血清稀释液（牛血清白蛋白1.00g＋0.01MPBS 100ml＋叠氮纳0.08g）稀释的一抗，4℃存放24-48h；吸去抗体，0.01MKPBS洗5min×3；

5。加入0.01MKPBS稀释的的二抗，室温孵育2h。0.01MKPBS洗5min×3；

6。加入ABC复合物之类的抗体，室温孵育2h，0.01MKPBS洗5min×3；蒸馏水迅速冲三次；

7。加入显色液，进行免疫组织化学显色，时间一般不超过30min，可不时在显微镜下进行观察，待细胞着色而背底颜色较淡时马上吸去显色液，用蒸馏水迅速冲三次后加入0.01MKPBS终止反应；