免疫印迹步骤

免疫印迹检测自噬相关蛋白（LC3II,Beclin1, 4EBP1, p70S6K, p62）表达： 1.液氮、研钵粉碎组织 ：实验前准备好液氮、冰、研钵、RIPA裂解液、EP管、枪；从-80℃冰箱中取出组织块，置于研钵中，倒入液氮后迅速研磨（？）分钟。用枪吸取研磨液置于EP管中，插入冰槽中维持（？）分钟。

2.离心：取出装有研磨液的EP管，并配装有同等量水的EP管进行离心，将两个EP管置于离心机内对称的位置，设置离心机参数：时间，转速（15,000转/分），温度（4℃），升速、降速。

3.提取蛋白：离心后，将EP管取出插入冰槽中，吸取上清液置于另一个空白的EP管中。

4.测定蛋白浓度：取上清收集完蛋白样品，为确保每个蛋白样品的上样量一致，需要测定每个蛋白样品的蛋白浓度。可以使用BCA蛋白浓度测定试剂盒（看说明书配液）。配好后，向蛋白样品中加入上样缓冲液，做好标记，最后置于-80℃冰箱中储存备用。

1）向96微孔板内分别加入25微升的标准品（A,B,C…I）

2）向微孔内加入蛋白样品，并用PBS液稀释（2微升蛋白样品，23微升PBS） 3）设置空白对照组为：裂解液+PBS

4）向所有微孔内加入A液和B液，比例为50:1（共200微升）37°下孵育30min副孔？

5.配胶：SDS-PAGE凝胶配制：先配分离胶，再配浓缩胶（浓缩胶更易凝固） 配胶前先准备好：大小胶板，固定装置，齿梳，配胶液（30%丙烯酰胺溶液，10%SDS，10%过硫酸铵，TEMED，1.5M Tris，1.0M Tris），枪（1000ul，100ul，20ul）

SDS-PAGE 分离胶浓度 6% 8% 10% 12% 15% 最佳分离范围 50-150kD 30-90kD 20-80kD 12-60kD 10-40kD

分离胶配方：

体积 超纯水 30%丙烯酰胺 1.5M Tris 10%SDS 10%过硫酸铵 TEMED

浓缩胶配方：

总体积 超纯水 30%丙烯酰胺 1.0M Tris 10%SDS 10%过硫酸铵 TEMED

（1）先准备胶板（一大一小）、固定装置及配胶液（30%丙烯酰胺溶液，10%SDS，10%过硫酸铵，1.5M Tris，TEMED），分离胶配液，用枪将配好的分离胶滴至两块胶板之间至分界线处

（2）加双蒸水加压，分离胶完全凝固后可见明显分界线（胶-水层）：注意是否有漏胶现象（可能由于胶板不齐，或没有夹紧）

1ml 0.68 0.17 0.13 0.01 0.01 0.01 2ml 1.4 0.33 0.25 0.02 0.02 0.02 3ml 2.1 0.5 0.35 0.03 0.03 0.03 4ml 2.7 0.67 0.5 0.04 0.04 0.04 5ml 3.4 0.83 0.63 0.05 0.05 0.05 6ml 4.1 1.0 0.75 0.06 0.06 0.06 8% 10ml 4.6 2.7 2.5 0.1 0.1 0.06 5ml 1.9 1.7 1.3 0.05 0.05 0.02 10% 10ml 4.0 3.3 2.5 0.1 0.1 0.04 15% 10ml 2.3 5 2.5 0.1 0.1 0.004 （3）凝固后，倒掉上层水分或用吸水纸吸去水分（在等待凝固过程，配置浓缩胶，但先不加过硫酸铵和TEMED液，易造成浓缩胶凝固过早） （4）配好浓缩胶，用枪快速加入到分离胶上层

（5）插入梳子，如果是在白天，则常温下静置20-30min，如是夜间则将配好的凝胶置于4℃冰箱过夜。 6. 上样、电泳(Electrophoresis)：

操作前准备以下：电泳设备，Tris，甘氨酸，SDS，超纯水，矿泉水瓶（1000ml），电子天平；配好的凝胶，Marker蛋白，蛋白样品，枪，枪头 1）电泳液配备：

总体积 Tris 甘氨酸 SDS 超纯水 500ml 1.51g 9.4g 0.5g 500ml 1000ml 3.02g 18.8g 1.0g 1000ml 2）从4℃冰箱取出配好的SDS凝胶，-20℃取出Marker蛋白，-80℃冰箱取出制备的蛋白样品；取下梳子，将胶板置于电泳槽内，胶板位置为内小外大，向槽内加入电泳液（注意是否有漏液）至没过内层胶板的高度，槽外电泳液高度为2-4板高度。最后向SDS-PAGE胶加样孔内分别加入Marker蛋白（置于最外侧）、样本蛋白。上样完成后连接电泳装置，打开电源开关，将电压调至80V，时间为30min，待Marker蛋白跑开后，将电压调至120V，90min,至电泳时间结束。 7.转膜(Transfer) ：

提前配好转膜缓冲液：甘氨酸、Tris、SDS，双蒸水，甲醇，转膜固定装置，黑色夹板，PVDF膜（6*8），尺子，镊子，玻璃棒。 转膜缓冲液配置

总体积 Tris 甘氨酸 SDS 甲醇 超纯水

1000ml 3.03g 14.4g 0.2g 200ml 1000ml 电泳结束后，关闭电源，将转膜器置于盘中，倒入缓冲液展开，铺开滤纸层；同时将PVDF膜置于甲醇中活化2min中，后取出置于装有缓冲液的盘中。取下电泳凝胶，启开小胶板，用尺子弃去浓缩胶层，并启开分离胶层置于滤纸上，将PVDF膜铺在胶层上面，再覆盖三层滤纸，将其夹紧。置于转膜器上（黑对黑），并导入少许转膜液，转膜槽周围放冰袋及碎冰，连接转膜器电源，于4℃下转膜。最后回收电泳液（附：PVDF膜，转膜的效果也可以用丽春红染色液对膜进行染色，以观察实际的转膜效果。也可以用考马斯亮蓝快速染色液对完成转膜的SDS-PAGE胶进行染色，以观察蛋白的残留情况。） 8.封闭：

提前准备好TBST，5%脱脂牛奶（1.5g奶粉，30mlTBST）

转膜完毕后，立即把蛋白膜放置到预先准备好的TBST洗涤液中，与摇床中快速漂洗5分钟，共3次。后用TBST配置5%脱脂牛奶，将漂洗后的膜转至封闭液中，在摇床上缓慢摇动,室温封闭2h。对。 9.一抗孵育(Primary antibody incubation) ：

准备好圆珠笔、尺子、剪刀、一次性透明手套，4℃冰箱中取出一抗蛋白，TBST。 封闭完毕后，漂洗蛋白膜3次，每次5min。按照适当比例用TBST稀释液稀释一抗。置于封口袋中，将蛋白膜按所需蛋白分子量剪取所需的条带，置于一抗稀释液中，可以在4℃冰箱中缓慢摇动孵育过夜。 回收一抗。加入TBST洗涤液，在侧摆摇床上摇动洗涤5分钟，共3次。 10.二抗孵育(Secondary antibody inucubation) ： 准备好二抗辣根过氧化物酶(HRP)，TBST。

按照适当比例用TBST二抗稀释液稀释辣根过氧化物酶(HRP)标记的二抗。 用微型台式真空泵吸尽洗涤液，立即加入稀释好的二抗，室温或4℃在侧摆摇床上缓慢摇动孵育一小时。 回收二抗。加入TBST洗涤液，在侧摆摇床上缓慢摇动洗涤5分钟。吸尽洗涤液后，再加入洗涤液，洗涤5分钟。共洗涤 3次。 8）曝光：蛋白检测(Detection of proteins) ，并进行结果分析。 准备好枪（1000ul），发光剂，蛋白条带。 附：

1) RIPA母液（20毫升配置示例）三0.158克氯化钠0.18克重蒸水10毫升浓盐酸调pH值至7.4 （约加100UL ）加40ul 0.5M高压过的EDTA定容至20毫升4 ℃保存使用前加为1mg/ml的抑肽酶100ul/100ml （ -20 ℃保存） ; 1mg/ml的的亮肽素100ul/100ml （ -20 ℃保存） ; 200毫摩尔/ L PMSF 500ul/100ml （ 4 ℃保存） ; 200毫摩尔/升的500ul/100ml四氧嘧啶（ 4 ℃保存） ， 200毫摩尔/ L的氟化钠500ul/100ml （ 4 ℃保存） 。因加完酶的RIPA液4 ℃只能保存五天，所以母液可以多配置，临用前再加酶。

2) 脑组织蛋白提取步骤：1 ，在冰上使玻璃平皿预冷。2，把脑组织放在预冷的玻璃平皿上，用剪刀将脑组织剪碎。3，用RIPA液悬浮脑组织。每250毫克脑组织加1毫升的RIPA 。4.冰上匀浆脑组织，直至匀浆光滑（大致用30min，多匀浆几次，每次匀浆间隔1min以上）。5，将匀浆转移到预冷的微量离心管中。6.4 ℃离心， 8,2000转20分钟留上清，弃沉淀。7，转移上清至另一离心管中。8.4 ℃离心， 18000转45分钟。9 。保存上清。（含有胞浆蛋白和部分亚细胞结构中的膜蛋白）