CLSI临床质谱新标准解读

CLSI 临床质谱标准 C62-A新内容解读

CLSI 临床质谱标准C62-A主题内容架构由基础内容部分包括（1）范围、（2）标准预防措施、（3）术语、（4）仪器；方法内容包括（5）预考察事项、（6）方法建立、（7）方法验证；质控内容包括（8）液质检验方法的质量保证与质量控制、（9）后续监督构成。其中方法和质控内容是与应用过程直接相关的。下面进行具体介绍。

5．预考察事项（preexamination considerations） 5.1目标分析物

内容包括5.1.1 外源性物质、5.1.2内源性物质、5.1.3 外源性和内源性物质的相关因素、5.1.4 样本采集。要充分了解目标分析物的性质，包含（1）目标分析物的临床意义如生理意义、临床价值、常用检测方法等；（2）理化性质如结构式、分子量、沸点、极性大小、酸碱性等；（3）存在形式如游离型、结合型；（4）干扰因素如类似物、同分异构体、其他代谢产物等；（5）预期浓度如常量级、微量级、参考区间浓度、切点浓度、病理浓度等；（6）样本类型如血清、血浆、全血、尿样、唾液、胆汁、组织等；（7）采集和处理方式如静脉血、足底血、指尖血、离心处理或静置、何种采血管等；（8）储存和运输方式如避光、冷藏、冷冻等。

5.2 内标

内标可以校正基质效应或者样本萃取、色谱分离、离子化过程中产生的偏差，有利于提高定量分析的准确性和精密度及方法稳定性。

5.3 试剂和耗材的质量

5.3.1 试剂盒耗材的质量：由于MS灵敏度高，因此试剂和耗材要求也高。在使用前应对试剂、耗材进行验证，避免其中杂质对MS的影响。使用过程中应按照SOP进行保存、操作，避免污染。按照ISO 17025:2017进行批间次管控。

5.3.2 实验室设备：配置校准品和内标时，实验室应使用A级的容量瓶和移液器。 6．方法建立（assay development） 6.1离子转变（ion transition）

在建立和优化质谱采集参数的过程中，要先配制标准物质溶液直接导入质谱检测器进行质谱扫描，获取目标化合物的相关信息。根据目标分析物的极性选择合适的离子化方式：

ESI源适合中等偏大极性化合物、难挥发化合物或热不稳定化合物；APCI源适合有一定挥发性的中等极性或低极性的小分子化合物。根据化合物的功能基团选择正负离子模式，然后选择合适的离子对分别作为定量离子对和定性离子对。之后，优化化合物参数，包括离子源参数以及质谱扫描参数，使所选择的离子对质谱响应值最高。

6.2高效液相色谱固定相

色谱柱种类繁杂，色谱柱选择通常取决于目标分析物的元素组成和化学结构。弱极性固定相有C18、C8、苯基柱等，极性固定相有氨基柱、氰基柱、硅胶柱等。要注意色谱柱的耐压范围和pH使用范围。当更换色谱组时，应使用系统适用性样本（SSS）进行核查。

6.3高效液相色谱流动相

流动相的设计取决于目标分析物的理化性质和色谱柱的特性。影响分离效果的流动相参数包括溶剂组成和比例、流速、离子强度、pH值、添加剂和温度等。其中避免使用的添加剂有非挥发盐、无机盐（腐蚀离子源）、表面活性剂（抑制电喷雾）、离子对试剂（影响后续离子化）。进行梯度洗脱或等度洗脱时，要注意溶剂比例、进样量、运行时间、梯度范围、柱温、样品溶剂等因素对分析结果的影响。应明确标注流动相的有效期。

6.4参数考察（examination variables） 6.4.1保留时间

控制流动相、色谱柱及外部条件（如温度）等。要预混合、防蒸发、控制pH值、保证泵流速。要求每次检测保留时间变化在±2.5%内。

6.4.2色谱分辨率

应达到基线分离Rs>1.25。可以通过增加色谱柱长度、改变流动相组成和比例、减缓梯度、降低流速和提高柱温来实现良好的色谱分离。

6.4.3其他改善色谱质量的因素如使用保护柱、减少死体积、检查管线连接到位等。 6.4.4信噪比

LLMI处S/N至少大于10，建议大于20。改善S/N的措施有考察基质效应、再优化提取效率、离子源参数、洗脱梯度、重组溶液、进样体积，优化驻留时间，优化进样量，优化前处理以及考虑衍生。

6.4.5色谱峰数据点和积分

推荐15-20个数据点，定量项目最低不少于10个数据点进行拟合。采集数据点的个数应与驻留时间有关。采用正切斜滑（tangent skim）方式积分非基线分离色谱峰。

6.5误差来源

6.5.1由基质效应引起

生物样本高度复杂，基质组成一般包括盐类、脂类、蛋白、多肽有机小分子等。盐类、脂类（特别是磷脂）是离子化效率最重要的影响因素。多数基质干扰可以通过样品前处理或色谱分离去除。

6.5.2碎片离子的交叉干扰

如果两个碎片离子有相同的m/z，并且同时进入碰撞室可能会发生干扰。新筛等项目需要同时采集多离子通道信号时也可能会发生碎片离子干扰。驻留时间和切换通道时间极端（<1ms）时也易出现碎片离子交叉干扰。

6.5.3内调和校准品的杂质 6.6方法校准（assay calibration） 6.6.1概述 6.6.2校准物质

建议实验室购买和使用商品化的标准品，如无法获得商品化标准品则可以自配。校准物质应具有确定的纯度和稳定性信息。只要可能，校准物质的定值应溯源至参考方法（ISO 17511）。推荐使用有证标准物质（CRMs），但是可供目前使用的CRMs较少。不推荐使用无基质溶剂配制校准品，除非证明该操作不会引起基质效应。CRMs可用于验证商业校准品或实验室自配校准品的定值，但是应注意基质效应。

用于配制校准品的基质要尽可能与临床样本相似。对于外源性分析物，不含分析物的生物体液可作为理想的基质。对于内源性分析物，推荐使用“模拟”基质减少基质效应，经透析、活性炭处理的临床样本可作为“模拟”基质。若处理后分析物残留仍>20%LLMI则可使用人工合成基质。实际样本难以除去内源性待测物时也可使用溶液基质校准品。上述均应注意考虑基质效应。总结来说就是校准品原材料“级别”越高越好。配制用的基质与临床样本越相似越好。要时刻注意考察基质效应。

6.6.3校准品的数量和位置

FDA规定校准应包括空白、零点、6-8个浓度点（建立标准曲线）。在实际操作中，标准品的浓度点应定位于LLMI和ULMI，以及分析范围内的所有相关医学决定水平点。弱标准曲线范围跨度超过3个数量级（如10-1000），或范围内存在非线性区间，建议增加标准品数量或者缩小浓度检测范围。建议在每个检测批次前运行标准曲线。或实验的定标频率能保证检测质量，则可视具体情况而定。

6.6.4生成曲线

6.7预验证（preverification）—评估基本性能参数 6.7.1选择性和特异性

第一步：进行背景噪音评价。双空白样本（无目标分析物/无内标）反应LC/MS系统的整体背景噪音。应满足以下要求之一：无背景峰、背景峰面积小于LLMI处分析物峰面积的20%、小于等于预期保留时间处IS峰面积的5%。

6.7.2基质效应的评估

基质效应是指在样本测试过程中，由于目标分析物以外的其他物质的存在，直接或间接影响目标分析物响应的现象。C62~专指对质谱系统的基质效应；互通性评价~一般指常规方法基质效应。基质效应可能会对分析产生一般性或样本特异性的影响，引起灵敏度和回收率的损失，引入误差，是对LC-MS方法验证的重要一环。

推荐方法为提取添加实验—前处理为液液萃取、蛋白沉淀等。其中set1含有待测物+内标+流动相，set2含有待测物+内标+提取后基质，set3含有待测物+内标+未提取基质（样本）。对比set2/set1可以评估基质效应，对比set3/set2可以评估提取效率，对比set3/set1可以评估前处理回收率。提取添加实验的设计和结果计算应制备5条不同的标准曲线（基质实验应做5批，计算结果的平均值），每批包含5种不同的基质（样本）。结合Tea考虑，如果精密度>15%，需要重新优化方法，如果在一个样品基质中自方法的灵敏度和特异性不能满足要求，需要重新优化方法。

还有柱后灌注实验可直观的评估基质效应。

基质混合实验（CLSI EP-07）方法：混合含有目标分析物的不同机制样本（通常为纯溶液样本和生物基质样本）分别处理后进样分析，比较混合液样本的响应值与生物基质样本和纯溶液样本响应值的均值，评估基质效应是否存在和影响目标分析物的准确定量。当基质效应评价结果不理想时，可以使用同位素内标进行补偿和抵消。还可以减少进样量，稀释样品，降低流速。还可以优化样本前处理，优化流动相条件使目标分析物的出峰时间错开发生离子抑制的时段，更换添加剂如TFA，更换色谱柱，更换离子化方法如ESI换APCI，或者尝试使用其他型号品牌的质谱系统。

6.7.3交叉污染（携带污染）

LC-MS是由连续流路组成，这种一体化的检测系统会增加高浓度样本残留风险。目前，尚无临床指南设定LC-MS的允许残留标准，但携带污染不应对检测准确性或精密度产生显著影响。无论同一次运行的其他样本中分析物的浓度如何，分析空白样品时的检测器信号都应该远低于LLMI（如25%）。评级方法参见CLSI EP-10或FDA指南。如果携带污染大于