试验一人基因组DNA的提取

第二篇 细胞的遗传物质

第一章 细胞内核酸的提取

人类基因组计划的完成以及后基因组学研究的不断深入，标志着现代医学的发展已逐步进入“基因组医学”的时代。疾病分子机制的研究也将为包括疾病的分子诊断、分子治疗在内容的“分子医学”的发展提供动力。

核酸是遗传信息以及基因表达的物质基础，是重要的生物信息分子,也是分子生物学研究的主要对象。它与生命的正常活动，如种族遗传、生长等有密切联系；它与生命的异常活动，如肿瘤的发生、放射损伤以及抗癌、抗病毒药物的作用机理等也有密切的关系。因此，核酸是现代生命科学体系中重点研究的课题之一。核酸分为DNA和RNA两大类。核酸的提取是分子生物学实验技术中基本的操作之一，

第一节 真核细胞基因组DNA的分离与纯化

DNA主要在细胞核内，核外也有少量称为核外基因的线粒体DNA等。真核细胞的DNA分子比原核生物的DNA分子大得多，并且以核蛋白体形式存在于细胞中。真核细胞基因组DNA提取的主要步骤包括裂解和纯化两大步骤。裂解是使样品中的核酸游离在裂解体系中的过程，纯化则是去除体系中的其它成分，如蛋白质、多糖、脂类及其它不需要的核酸（RNA）等生物大分子的过程。

一、裂解

细胞破碎的手段常为超声波、组织匀浆、液氮破碎以及包埋组织的超薄切片等方法。为了获得大量完整的DNA，一般采用裂解液等温和的方法破碎细胞。

裂解液一般都含有去污剂 (如 SDS、Triton X-100、NP-40、Tween 20 等) 和盐 (如 Tris、EDTA、NaCl 等)。去污剂的作用是通过使蛋白质变性，破坏膜结构及去除与核酸相连接的蛋白质，从而实现核酸游离在裂解体系中。盐的作用，一方面提供一个合适的裂解环境 (如 Tris)，另一方面可抑制核酸酶在

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裂解过程中对核酸的破坏 (如 EDTA)、维持核酸结构的稳定 (如 NaCl) 。裂解体系中还可以加入蛋白酶；利用蛋白酶将蛋白质消化成小的片段，促进核酸与蛋白质的分开，便于后面的纯化操作以及获得更纯的核酸。

二、纯化

根据DNA本身的特征使用不同方法进行核酸提纯。 三、DNA提取的实验步骤 （一）材料与设备

1.试剂 消化液（100mmol/L NaCl,10mmol/L Tris-HCl，pH8.0，25mmol/L EDTA，0.5%SDS，0.1mg/ml蛋白酶K）；pH8.0，25mmol/L EDTA；PBS；TES饱和酚；氯仿；异戊醇； 95%乙醇溶液；70%乙醇溶液；TE；0.1%SDS；1μg/ml RNA酶；

2.仪器 培养皿、培养瓶、微量离心管、滴管；刻度吸管；加样器；枪头；离心机、液氮罐、组织匀浆器、恒温培养箱

（二）主要步骤

1.如果材料为组织块，可将组织块（约200~1000mg）剪碎后，置入液氮中。随后用冰冷的组织捣碎器捣碎，每100mg组织加入1.2ml消化液（100mmol/L NaCl,10mmol/L Tris-HCl，pH8.0，25mmol/L EDTA，0.5%SDS，0.1mg/ml蛋白酶K）。

2.如果材料是悬浮细胞，收集细胞于微量离心管中，500g×5min离心；如果材料是贴壁细胞，弃上清后，胰酶消化收集细胞，500g×5min离心。随后用冰冷的PBS缓冲液洗涤细胞，500g×5min离心，弃上清，重复一次，并用一倍体积的消化液重悬细胞。

3.组织或细胞混悬液移入带盖的离心管中，50℃消化12～18h。 4.冷却至4℃，加等体积15 mo1／L TES饱和酚。 5.轻轻振摇，使水相和酚层充分混匀。

6. 4℃5000rpm～8000rpm离心15min～20min。此时DNA溶液在上层，酚位于下层，中间是变性蛋白层。

7.用吸管小心吸取上层粘稠溶液，移至另一离心管。注意尽量不要带出中间蛋白层。

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8. DNA溶液再加等体积15 mo1／L TES饱和酚抽提一次，按6、7离心并吸至另一离心管。

9.加等体积氯仿/异戊醇按步骤（5、6）抽提，离心5min。 10.吸出DNA溶液后，再步骤（9）抽提一次。

11.用吸管将DNA溶液移至Eppendorf中，冰浴至0℃。 12.加2.5倍体积95%冷乙醇震摇，可见DNA白色沉淀析出。 13.用75%冷乙醇清洗3～4次。 14.室温干燥或冷冻干燥DNA。 15.加适量TE溶液溶解DNA。 四、结果鉴定

1．紫外分光光度计检测：可检测DNA的纯度和含量。一般而言核酸在260nm时吸光度最大，而蛋白质在280nm时吸光度最大。取2μl DNA溶解液，适量稀释，紫外分光光度计测定260nm、280nmOD值，计算OD260/OD280比值，比值在1.7?2.0:1之间，说明DNA纯度可。在260nm处，1OD双链DNA的浓度为50?g /ml，据此可计算DNA的浓度（?g /ml）=50×(OD260) × 稀释倍数。

2．电泳检测：可检测核酸的完整性和大小。取2μl DNA溶解液与适量上样缓冲液混合后，经1%琼脂糖凝胶电泳。电泳结束后紫外光下观察，拍照；如果观察到一条清晰的电泳带，无明显的拖尾，说明DNA完整性好。

第二节 真核细胞总RNA的分离提取

RNA是基因表达产物，由以下几类分子组成，rRNA（占细胞总RNA的80%～85%）、tRNA和核内小分子RNA（占10～15%）、mRNA（占1～5%）。其中mRNA是分子生物学的主要研究对象，分离制备mRNA是克隆基因，分析基因表达以及建立cDNA文库的首要步骤。

真核细胞总RNA分离提取的目的是要获得高纯度的具有充分长度的RNA分子，包括RNA的纯度和完整性。RNA分离的关键是尽量减少RNA酶的污染。RNA酶活性非常稳定，分布广泛，除细胞内源性的RNA酶外，环境中也存在RNA酶。因此在提取RNA时，应尽量创造一个无RNA酶的环境，

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包括去除外源性RNA酶的污染和抑制内源性RNA酶活性。主要是采用RNA酶的阻抑蛋白RNasin和强力的蛋白质变性剂盐酸胍或异硫氰酸胍抑制内源性RNA酶，采用焦碳酸二乙酯（DEPC）去除外源性RNA酶。

一、RNA提取 的关键

真核细胞RNA的提取过程有四个关键点，即①样品（细胞或组织）的有效破碎；②有效地使核蛋白复合体变性；③对内源RNA酶的有效抑制；④有效地将RNA从DNA和蛋白混合物中分离；其中最关键的是抑制ＲＮＡ酶活性。提取的RNA可以用于核酸杂交、cDNA合成以及体外翻译等。

二、组织RNA提取的基本步骤

1.仪器：匀浆器、低温离心机、离心管。

2.试剂：氯仿、75%乙醇、异丙醇、DEPC溶液、1%甲醛变性胶、37%甲醛、3%过氧化氢、甲酰胺、RNA上样缓冲液。

3.主要步骤

（1）取组织50~100mg，加0.8ml Trizol冲洗匀浆器，移入同一离心管，冰上静置5min。

（2）加0.2ml氯仿，充分震荡混匀，静置3min，4℃，12000g×15min离心。弃沉淀。

（3）取上清，加入0.5ml异丙醇，颠倒混匀。－20℃静置2h，4℃，12000g×10min离心。

（4）弃上清，取沉淀，加入1ml 75%乙醇溶液，漂洗沉淀，4℃，7500g×5min离心。

（5）弃上清，沉淀真空干燥10min。 （6）加40μl DEPC溶液，充分溶解RNA。 4.结果鉴定

（1）紫外分光光度计检测：取RNA溶解液，按一定比例稀释后，紫外分光光度计测定260nm、280nmOD值，计算OD260/OD280比值，如果比值在1.7?2.0：1之间，说明RNA纯度可。

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