PFGE（脉冲场凝胶电泳） 标准操作规程(SOP)

PFGE（脉冲场凝胶电泳） 标准操作规程(SOP)

关键词：PFGE，脉冲场凝胶电泳

目的：运用PFGE方法对20Kb至数Mb的DNA进行分子分型

图谱分析：

采用“PFGE脉冲场凝胶电泳分子分型识别系统”（官微：PFGE_CHINA）进行图谱分析。 系统主要功能是PFGE图谱分子分型在线识别和处理，提供二叉层级聚树，MLVA、MLST字符类型的最小生成树，SEQUENCE基因片段类型的亲缘树计算和图形绘制，用于分析菌株之间的相关性，协助追踪感染来源以及有效控制疫情。

第一天

一、 胶块的制备

1、 在Falcon 2054管上标记样品名称和空白对照，分别加入约2ml细胞悬 浊液（CSB）；

2、 在1.5ml eppendorf管上标记好对应样品的名称； 3、 在模具上标记好对应样品的名称；

4、 用CSB湿润接种环，从培养皿上刮取适量细菌，均匀悬浊于CSB中，

用bioMerieuxVitek colorimeter测其OD值，并调整至3.6~4.5。如果OD值大于4.5，加入CSB稀释；如果OD值小于3.6，增加菌量提高其浓度。

5、 取400μl细菌悬浊液于相应的1.5ml eppendorf管中，置于37℃水浴中孵 育5分钟。将剩余的细菌悬浊液置于冰上直到胶块制备好放在水浴摇床中。 6、 从水浴箱中取出eppendorf管，每管加入20μl蛋白酶K（储存液浓度为 20mg/ml）混匀，使其终浓度为0.5mg/ml。

7、 制备好1%Seakem Gold：1%SDS，放于56℃水浴箱中。

8、 在eppendorf管中加入400μl的1% Seakem Gold：1%SDS，用枪头轻轻 混匀。

9、 将混合物加入模具，避免气泡产生，在室温下凝固10-15分钟。 注意事项：

（1） 用后的接种环要放在指定的废弃物容器中。 （2） 细胞悬浊液、蛋白酶K要置于冰上。

（3） 在混合细胞悬浊液和1% Seakem Gold：1%SDS时要避免气泡的产生。 （4） 混合物加入模具时不能产生气泡。

（5） 在加1% Seakem Gold：1%SDS的过程中1% Seakem Gold：1%SDS要一直放在56℃水浴箱中。

二、 细胞的裂解

1、 在50ml的screw-cap tube上做好标记。

2、 配制细胞裂解液（CLB）：每5ml细胞裂解液加入25μl蛋白酶 K（20mg/ml），使其终浓度为0.1mg/ml，然后颠倒混匀。

注意：蛋白酶K要置于冰上，配制好的细胞CLB也要置于冰上。 3、 每个管子加入5ml蛋白酶K/CLB混合液。

4、 如果想使胶块平齐，可以用刀片削去模具表面多余的部分。

（1） 可重复利用的模具：打开模具，用小铲的宽头部分将胶块移入相应的screw-cap管中。

（2） 一次性模具：撕掉模具下面的胶带，用小铲将胶块捅进相应的screw-cap管中，将模具、胶带、小铲放入废弃物容器中。 5、 保证胶块在液面下而不在管壁上。

6、 将管子放在54℃水浴摇床中孵育2小时，转速约170转/分钟。 7、 将纯水和TE放在50℃水浴摇床中预热。 三、洗胶块

1、 从水浴摇床中拿出screw-cap管，盖上绿色的screened-cap。轻轻倒掉 CLB。在实验台上轻磕管底使胶块落在管底。 注意：

把管倒置在吸水纸上，使管内液体被尽量排除干净。随后的操作中也如此。 2、 每管中加入15ml预热的纯水。

3、 确保胶块在液面下而不在管壁或盖子上，放回50℃水浴摇床中，摇10分钟。 4、 倒掉水，用纯水再洗一次。、

5、 倒掉水，加入15ml预热的TE，在50℃的水浴摇床中摇15分钟。 6、 倒掉TE，用TE重复洗三次，每次10－15分钟。 7、 倒掉TE，加入10ml TE，放在4℃冰箱保存备用。 注意：要确保胶块在液面下而不在管壁或盖子上。 四、胶块内DNA的酶切

1、 在1.5ml eppendorf管上标记好相应的样品及H9812的名称。 2、 按照下面的比例配制缓冲液H的稀释液，混匀。 试剂 μl/胶块 μl /10胶块 纯水 180μl 1800μl Buffer D 20μl 200μl 总体积 200μl 2000μl 注意：缓冲液要置于冰上。

3、 在每个1.5ml eppendorf管中加入200μl缓冲液H的稀释液。 4、 小心从TE中取出胶块放在干净的培养皿上。

5、 用刀片切下2mm宽的胶块放入1.5ml eppendorf管中。确保胶块在液面下面。将剩余的胶块放回原来的TE中。

6、 用同样的方法处理标准株H9812的胶块。 7、 将管子放在37℃水浴中孵育10-15分钟。

8、 在用稀释缓冲液孵育的过程中，按照以下的比例配制酶切缓冲液，混匀。 试剂 μl/胶块 μl /10胶块 纯水 175μl 1750μl Buffer D 20μl 200μl 酶（10U/μl） 5μl 50μl 总体积 200μl 2000μl 注意：

（1） 将酶置于冰上，用后立即放在－20℃保存。 （2） 用枪头吸出缓冲液H，避免损伤胶块。

9、 每管加入200μl混合液，轻轻在实验台上磕管子的底部，确保胶块在液面的下面。 10、 在37℃水浴中孵育至少2小时。 五、加样

（一）将胶块直接粘在梳子齿上

1、 调整梳子的高度，使梳子齿与胶槽的底面相接触。用水平仪调整胶槽使 其水平。

2、 从37℃水浴中取出胶块，平衡到室温。

3、 用枪头吸出酶切混合液，避免损伤或吸出胶块。 4、 每管加入200μl 0.5×TBE。

5、 把梳子平放在胶槽上，把胶块加在梳子齿上。如果用的是10个齿的梳 子，把标准菌株H9812加在第1、5、10个齿上。

6、 用吸水纸的边缘吸去胶块附近多余的液体，在室温下风干约3分钟。 7、 把梳子放入胶槽，确保所有的胶块在一条线上，并且胶块与胶槽的底面

相接触。从胶槽的下部中央缓慢到入100ml熔化的在55℃－60℃平衡的1％SKG。避免气泡的生成；如果有，用枪头消除。在室温下凝固30分钟左右。 8、 记录加样顺序。

（二）将胶块直接加在加样孔内

1、 调整梳子的高度，使梳子齿与胶槽的底面有一定间距。用水平仪调整胶 槽使其水平。

2、 把梳子放入胶槽，从胶槽的中央缓慢倒入100ml熔化的在55℃－60℃平 衡的1％SKG。避免气泡的生成；如果有，用枪头消除。在室温下凝固30分钟左右。 3、 小心拔出梳子。

4、 从37℃水浴中取出胶块，平衡到室温。

5、 用枪头吸出酶切混合液，避免损伤或吸出胶块。 6、 每块胶加入200μl 0.5×TBE平衡。 7、 用小铲将胶块加入加样孔。 8、 用溶化的胶封闭加样孔。 注意：

a) 可以在加样孔中加入0.5×TBE，利用毛细作用将胶块沉在加样孔底，尽量避免气泡形成。

b) 记录加样顺序。 六、电泳

1、 确保电泳槽是水平的。如果不水平，调整槽底部的旋钮。注意：不要触 碰电极。

2、 加入2.2L 0.5×TBE,关上盖子。

3、 打开主机和泵的开关，确保泵设在－70（这时缓冲液的流速约1L/分钟） 和缓冲液在管道中正常循环。

4、 打开冷凝机，确保预设温度在14℃（缓冲液达到该温度通常需要20分钟左右）。 5、 打开胶槽的旋钮，取出凝固好的胶，用吸水纸清除胶四周和底面多余的胶，小心的把胶放入电泳槽，关上盖子。 6、 设置电泳参数。

7、 记录电泳初始电流（通常120－145ma）。 8、 结束电泳：关机顺序为：冷凝机－泵－主机。 第二天

七、图像的获取

1、 取出胶，放在盛放400ml EB溶液的托盘内（EB储存液浓度为10mg/ml， 1：10,000稀释，即在400ml水中加入40μl储存液）。 注意：

EB是致畸剂。储存在棕色瓶中的EB稀释液可以用3-5次。废弃的EB溶液应妥善处理。 2、 将托盘放在摇床上摇25-30分钟。

3、 放掉电泳槽中的TBE，用1-2L纯水清洗电泳槽，并倒掉液体。

4、 戴上手套将用后的EB溶液小心倒入做有标记的棕色瓶中，在托盘中加

入400-500ml纯水，放在摇床上脱色60-90分钟，如果可能每20-30分钟换一次纯水。 5、 用Gel Doc 2000拍摄图像。

注意：如果背景干扰分析，可进一步脱色30-60分钟。 6、 转换成*.1sc文件用于处理分析。 八、数据的分析

图像的读取

电泳图像通常用BIO-RAD的GEL DOC 2000或其它成像系统来获取。其它可以替代的成像设备，只要具有CCD相机，可以提供IBM兼容的未压缩的TIFF图像，且分辨力≥768 x 640像素，能够用BioNumerics software (Applied Maths, Inc.)软件与PulseNet数据库中其它图像进行对比分析，也可以运用。 运用GEL DOC 2000的简单说明： QUANTITY ONE软件

1、 点击QUANTITY ONE按钮打开该软件。 2、 点击菜单FILE→GEL DOC。 注意：需要10－20秒打开窗口。

3、 打开抽屉，把胶放在台板上。胶已经经过EB或GEL-STAR染色并经过充分脱色。用黑色胶框把胶放在合适的位置。关上抽屉门。 图像的获取

1、 按下EPI-LIGHT按钮打开白光。

2、 把胶放在调准网格线内，使胶的加样孔和调准网格线的最上面一条蓝线对齐。 3、 保证调准网格线和过饱和按钮被选中。

4、 改变镜头的MIDDLE RING以调整图像的大（顺时针）小（逆时针），使图像占据整个窗口。如果需要，挪动胶在台板上的位置。胶的加样孔、下边界和左右边界在屏幕上都应该可以看到。

5、 如果需要，按BOTTOM RING以调整相机的焦距。

注意：焦距的调整只可以偶尔用之，不可用于每一块胶。可以用尺子帮助调整焦距。 6、 按下EPI-LIGHT关掉白光，按下UV按钮打开透射紫外光。

7、 点击AUTO EXPOSE以确定大概的曝光时间。当图像出现在窗口时，AUTO EXPOSE自动关闭而MANUAL EXPOSE被激活。 8、 点击MANUAL EXPOSE的↑↓按钮，调整曝光时间。而调整饱和度时，点击箭头或TURN THE TOP RING以降低光量（如果图像过饱和，图像显现红色）。

注意：如果出现对话框“曝光可以在0.03－360秒之间波动”，则需通过改变相机的像素以调整饱和度。调整饱和度使样品条带没有红色很重要，因为这会影响BIONUMERICS软件对胶图像的分析。而胶加样孔的过饱和属于正常现象。

9、 当图像调整的比较满意时，按下FREEZE按钮停止曝光过程。按下UV按钮关掉紫外光（如果开门时UV灯打开，它会自动关闭）。

图像的输出