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图1.(A)双脱氧链终止法测序，在四管反应系统引入ddNTP,每管反应体系合成长度不等的核酸片段；之后进行凝胶电泳，经过放射自显影，根据片段3'端的双脱氧核苷，便可依次阅读合成片段的碱基排列顺序。(B)454测序, 采用矩阵分析技术，使得矩阵上的DNA样本可以被同时并行分析。(C)单分子测序仪,工作时先将DNA聚合酶固定在测序芯片的反应孔底部，DNA聚合酶捕获加入的DNA测序单链，四种不同荧光标记的dNTP 加在反应孔的上端，根据标记荧光基团发射波长的不同，可以识别延伸的碱基种类。(D)生物纳米孔和固态纳米孔的结构，a: 溶血素，溶血素内孔径大小刚好允许单链DNA 分子通过，是十分理想的纳米孔材料;b:固态纳米孔,根据采用的工艺不同,纳米孔的几何形状和尺寸也有所不同,一般用于DNA测序的纳米孔直径要求小于 5 nm。
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2基因测序技术应用
测序技术有利于我们更好地进行科学研究。第一代DNA测序技术就在人类基因组计划中有着至关重要的作用，加快了人类基因组计划的实现[17]。其作为早期测序技术有着自身优缺点，现如今还在被人们使用。但随着第二代测序技术的出现，用第二代测序技术解决科学问题成为更普遍的事情。当今，高通量测序开始在寻找疾病的候选基因上应用广泛。第二代测序技术使得核酸测序的单碱基成本与第一代测序技术相比急剧下降,测量通量明显提高。[18]因此，第二代测序技术加快了基因组研究的进展步伐，让所有实验室皆可开展基因组测序工作。
目前，一些测序技术被主要应用于科研院所、企业研发部门等。例如，半导体测序是通过检测DNA链在延伸的过程中产生的H+，实现边合成边测序。[19,20,]
HeliScope测序技术是基因组DNA经过剪切、多聚腺苷酸加尾并固定于测序芯片表面后，A、C、G、T四种荧光修饰的dNTP 依次循环流加至芯片上，当碱基互补延伸后，采集荧光信号获得碱基信息，之后酶切去除荧光基团，随之进行下一轮反应。纳米孔测序技术利用镶嵌于脂质双分子层中的经过基因工程改造过的α-溶血素蛋白作为纳米孔道，并在α-溶血素蛋白孔道上部和中部分别连接一个核酸外切酶和一个氨基化环糊精配体。在测序反应开始时，核酸外切酶逐个切割单链DNA分子上的脱氧核糖核苷酸分子，切割后的脱氧核糖核苷酸分子进入纳米孔，经过氨基化环糊配体时，将会引起电流的变化。由于四种脱氧核糖核苷酸与甲基化嘧啶脱氧核糖核苷酸引起电流变化幅度不同，从而可以区分不同的碱基，进而测定DNA 链的序列。作为新兴的第四代 DNA测序技术，具有低成本、高读长、易集成等优势。如今，随着半导体工艺技术的飞速发展，小型化、高速度、大通量的纳米孔测序芯片的实现成为可能。
目前，具代表性的第二代测序平台有瑞士罗氏（Roche）公司的454，美国Illumina公司的基因组测序仪、HiSeq2000和MiSeq，美国应用生物系统(Applied Biosystems,ABI)公司的寡聚物连接检测测序5500XL，美国生命科技（Life Technologies）公司半导体测序个人化操作基因组测序仪（表1）；第三代测序平台有美国螺旋生物科学（Helicos Biosciences）公司的Heli-Scope遗传分析系统和太平洋生物科学（Pacific Biosciences）公司的单分子实时测序（SMRT）技术；第四代测序技术有英国牛津纳米孔 (Oxford Nanopore Technologies) 公司的纳米孔测序技术。[25]
表1： 公司名称
技术原理
商业模式
Illumina 合成测序
测序仪、试剂耗材销售，测序及解读服务 测序仪、试剂耗材销售
Life Tech
基于磁珠的大规模并行链接DNA测序
大规模并行焦磷酸合成测序
Roche
测序仪、试剂耗材销售，2013年停产
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3基因测序技术前景展望
基因测序技术的出现对生命科学和医学的发展起到了革命性作用，自1977年Sanger发明链终止双脱氧链终止法、Maxam和Gilbert发明化学降解法的第一代测序技术以来，基因测序技术不断发展。随着技术革新，DNA测序技术得到了不断的创新，在保证测序准确度的前提下，逐步优化操作程序，使得测序速度逐渐提高，测序成本也呈下降趋势，下一代测序技术（Next-generation sequencing，
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NGS）就应运而生，NGS技术又称大规模平行测序或深度测序，包括第二代、第三代和第四代测序技术。
第三代和第四代测序技术目前处于发展阶段，虽读长比Sanger 测序法长十几倍，但Pac Bio RS 单分子实时测序系统和Min ION 测序仪错误率高，还有待改进。[26]基因测序技术向将向更高通量、更高精度、更低成本的方向发展，测序速度达到1万个碱基/秒、测序成本不到1000美元的小型基因组测序仪呼之欲出；一次并行测定数百种微生物的低价测序也不是梦想。更高通量与精度、更低成本的测序技术定会出现，全民个体化健康的时代也必将到来。[27]
基因测序技术对揭示基因组的结构和功能已经并正在发挥重要的推动作用，基因测序技术的日渐成熟，在功能基因组、系统生物学和药物基因组的研究中将会发挥广泛作用。比如说，新一代基因测序技术能鉴定出更多新的与肿瘤相关的基因，且成本更低，这为肿瘤的个体化基因治疗提供条件，[28,29]此外，微生物在
[30]
调节人体的内分泌系统及免疫系统中发挥重要作用，随着基因测序技术的发展，有望实现从基因水平及分子结构掌握其功能作用的机理，对今后的健康管理有一定指导作用。总之，基因测序技术的发展无疑推动了生物、医疗、化学和计算机等多领域的发展，将使生命科学研究进入新的纪元！
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参考文献
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