全内反射荧光显微术及其在生物单分子科学中的应用（精）

4. 生物单分子荧光探测

真正意义上的单分子荧光探测,有很多的困难,但是还是可能的。单分子荧光探测主要有三个问题:(1单分子发出的荧光信号通常是很微弱的,所以要寻找一个足够灵敏的探测器。(2由于拉曼散射,瑞利散射和杂质荧光等产生的背景光,极大的干扰了信号光的探测。所以应该尽量降低背景激发光。(3本体溶液产生的焦点荧光之外的背景光。这些问题都可以利用全内反射荧光显微成像系统来解决[5]。

近年来,超灵敏的探测设备的飞速发展,为在最普适的生理状况下实现生物单分子的荧光探测铺平了道路,解决了问题(1。超灵敏的探测设备如单光子计数的雪崩光电二极管,可以达到5%的探测效率,即100个光子中有5个光子可被探测到。这样,从单个典型的荧光团的光发射中可以探测到约5000~50,000个光子。这个数目不仅对实现单分子探测是足够的,对光谱识别和一定时域内的实时监控也是足够的。对于包含单个的荧光团如荧光素、若丹明或蓝色素的分子来说,这种估算是严格的。而对于生物大分子而言,如蛋白质和核酸,为了加强信号的强度,每一个分子要用很多个相同的荧光团来标记[4]。还有当今最灵敏的成像探测器电子倍增电荷偶联设备(Electron Multiplying Charge Coupled Device,它的优点主要在降低了噪声读取基底,高的量子效率(可以达到90%以上,最少的暴光时间,降低了激发所需的强度,降低了荧光团浓度,增加了放大倍数。无可比拟的信噪比。因此是最先进的用来做单光子检测的科学CCD照相机[6]。

全内反射显微成像是采用隐失波照明。隐失波在平行界面方向以行波场方式传播,在垂直界面方向则是一个指数衰减场。所以这种显微成像技术成像的视野开阔,

同时探测样品的厚度却很薄,约为百纳米量级,从而解决了问题(2和(3,可以将拉曼散射,瑞利散射和杂质荧光等产生的背景光减小到极低的水平,也使得在百纳米量级范围以外的本体溶液因为没有激发而得已解决。

5. 在生物单分子研究中的应用

细胞内的很多至关重要的生命活动过程如信号转导,蛋白质转运,病原体侵入均与细胞表面有关,如果我们可以直接对这些细胞表面的过程进行观测,而不受到来自细胞内深层区域信号的干扰,这对细胞生物学研究来说,将是具有重大意义的突破。全内反射荧光显微术正是凭借其独特的优势,它的荧光激发深度只在~200nm的薄层范围内,从而成为研究细胞表面科学如生物化学动力学、单分子动力学的最有前途的光学成像技术[7]。如图3。

现在全内反射荧光显微术已被广泛用于实时观察单个肌浆球蛋白分子的运动、单个蛋白分子对之间的荧光共振能量转移(FRET、ATP酶的翻转[8,9],聚合物内单个分子的结构变化[10,11],等离子体膜附近的神经分泌腺的颗粒运动[12],胞内吞和胞吐[13,14]等多方面。

图3 利用物镜型全内反射荧光显微镜观察活细胞表面示意图。 6. 与其他生物单分子研究技术的比较

图4活细胞单分子显微镜方法比较。

以活细胞研究为例,全内反射荧光显微镜与其他单分子技术相互补充,从不同的角度研究细胞[15],如图4。单粒子追踪术(SPT,单染色示踪术(SDT,扫描近场光学显微镜(SNOM,原子力显微镜(AFM和分子识别力显微镜(MRFM都是研究放置在固体平面支撑物上活细胞的上表面细胞膜的技术,SPT和SDT是都是成像技术,SPT利用胶体金粒子来标记细胞表面分子,从而在纳米精度和毫秒尺度上追踪细胞表面分子的运动。SDT利用荧光分子来标记细胞表面分子,利用荧光分子来观察。SNOM具有较高的侧向分辨率,而在细胞表面,分辨率显著的降低,而且由于其较长的成像获取时间而不能用于对运动的结构成

像,AFM与SNOM具有相似的高的侧向分辨率,细胞表面成像是分辨率显著的降低,也不能对运动的结构成像,MRFM是在AFM的基础上,对AFM针尖进行修饰, 利用生物素-抗生物素蛋白,细胞黏附蛋白,抗体-抗原之间的相互作用来研究细胞表面的一些性质的一种技术。

共聚焦激光扫描显微镜(CLSM和双光子激光扫描显微镜(TPLSM则是可以检测细胞质内荧光的技术,CLSM的重要优势在于,它提供了仅从单光学薄层收集光波的可能性。与聚焦平面共轭的针孔定位(即共焦可避免来自检测器之外的光,即从聚焦平面以外的其它地方反射/发射过来的光。但是这个光学薄层的厚度大约为500-800nm,要大于全内反射荧光显微镜的光学薄层的厚度(200nm,而且其较长的成像获

取时间使得在毫秒尺度上进行的组成型改变和动力学重排研究成为不可能。TPLSM对生物系统和体内细胞性质具有高的分辨率,如细胞器,细胞连接,细胞内钙离子浓度,细胞膜流动性。

全内反射荧光显微镜(TIRFM则是研究紧贴固体平面支撑物的细胞膜的技术,但是正因为膜与固体支撑物具有相互作用,以及隐失波强度的指数性下降而导致单分子信号的指数性下降,使得对结果的解释具有一定的困难性。因此将全内反射荧光显微术与其它的显微成像技术相结合来研究将是未来发展的一个新的方向。

全内反射荧光显微术在短短的十几年中发展十分迅猛,已经成为生物单分子科学研究必备的工具之一,它将成为细胞-基底接触区域内的丰富的细胞生命活动最强有力的探测方法。如细胞膜内蛋白质的动力学过程,基底附近的细胞骨架,细胞运动等。在未来的一段时间内,全内反射荧光显微术将会主要从两个角度去改进:光电探测设备探测效率和探测速度的提高以及单分子染色技术的发展。

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