全内反射荧光显微术及其在生物单分子科学中的应用（精）

全内反射荧光显微术及其在生物单分子科学中的应用

北京大学力学与工程科学系生物医学工程专业02级博士钟建学号: 10203829 摘要:全内反射荧光显微技术利用全内反射产生的隐失波激发样品,由于隐失波强度成指数衰减,使激发区域限定在样品表面的一薄层范围内,因此具有其它光学成像技术无法比拟的高的信噪比。它是当今世界上研究单分子科学最具前途的新型生物光学显微技术之一,可以用来实现对单个荧光分子的直接探测。近年来,已被生物物理学家们广泛应用于单分子的荧光成像中。本文主要介绍了全内反射荧光显微技术的基本知识及其在生物单分子科学上的应用。

关键词:全内反射荧光显微技术,生物单分子,隐失波

生物单分子研究是指在单分子水平上对生物分子行为(包括构象变化、相互识别、相互作用等的实时﹑动态检测以及在此基础上的操纵和调控等,籍此深入阐明构效、构性关系。生物单分子研究已经成为21世纪生命科学领域的一个重点研究方向。在生命科学领域有着广泛的研究前景。生物单分子研究要求发展超高分辨率的成像技术,从而在分子尺度上探测生命活动的细节。

新一代光学显微技术以其高的空间分辨率和时间分辨率、无损伤、以及对单分子活体探测的可行性,成为生物学家和物理学家的研究热点。目前国际上公认的最有前途的单分子光学成像技术有全场相衬显微术、共焦荧光显微术,近场光学扫描显微术和全内反射荧光显微术[1]。这些技术在分子生物学、分子化学、激光医学及纳米材料等领域受到广泛关注,并产生了深远的影响。其中,全内反射荧光显微术是近年来新兴的一种光学成像技术,它利用全内反射产生的隐失场来照明样品,从而致使在百纳米级厚的光学薄层内的荧光团受到激发,荧光成像的信噪比很高。这种方法的成像装置简单,极易和其它成像技术、探测技术相结合。目前已成功的实现200nm甚至更低的空间分辨率。因此被生物物理学家用来观察单分子成像,也被细胞生物学家和神经科学家来观测发生在细胞膜上的生理反应[2]。

1. 全内反射的基本理论

全内反射是一种普遍存在的光学现象。考虑一束平面光波从折射率为n1的介质进入到折射率为n2的介质中。入射光在表面上一部分发生反射,另一部分则发生透射。入射角θ1和透射角θ2之间满足关系式

n1sinθ1=n2sinθ2(1

若n1大于n2,例如折射率为θ1的是玻璃,折射率为n2的是液体溶液。当入射角增大,增大到临界角θc时,这时的透射角为90°,当入射角大于或者等于临界角时,光不再透射进溶液,也就是发生了全反射,如图1所示。由snell定律可知

θ2=90°θc=sin-1(n2/n1 (2

由上式可知,当n1大于n2时,全反射就可能发生。如果玻璃的折射率取为1.52,溶液的折射率取为1.33(生物细胞的折射率范围是1.33~1.38,则玻璃/界面处的临界角为61.74°。从几何光学的角度来看,当光发生全反射时,光会在玻璃界面上完全反射而不进入液体溶液中。实际上,由于波动效应,有一部分光的能量会穿过界面渗透到溶液中,是一种非均匀波,它沿着入射面上的介质边界传播,而振幅随离界面的距离z作指数衰减。可以看出,透射电

磁场的振幅随进入样品的深度z减小得非常快,这种电磁场只存在于界面附近一薄层内,因此,我们称此非均匀场为隐失场,。其在第二介质中的有效进入深度约为一个波长[3]。隐失波激发在一个波长范围之内的荧光分子发出荧光(如图1。

图1 左图为全内反射示意图。箭头表示激光的方向,激光被全反射,同时产生在z方向成指数衰减的隐失波。黄色小圆点表示被隐失波激发的荧光分子,白色小圆点表示未被激发的荧光分子。右图表示隐失波的强度-深度图。

2. 全内反射的仪器组成

到目前为止,已经发展了多种全内反射荧光显微镜成像系统。其中最为普遍的有两种类型:棱镜型和物镜型[2]。如图2。

图2 两种类型的全内反射荧光显微镜成像系统,1为棱镜型,2为物镜型。 棱镜型成像系统只需要显微镜,棱镜和激光光源,所以容易实现。棱镜作为发生全内反射的光学器件。物镜只是作为荧光信号收集器。在探测上,它也不容易受到入射光的干扰。缺点是放置样品的空间位于棱镜和盖玻片之间,所以样品大小和样品的放置受到限制。而在物镜型成像系统中,显微镜的物镜既是发生全内反射的光学器件,又是样品荧光信号的收集器。其优点是样品的大小没有棱镜的限制,样品的放置非常方便,并且由于样品远离物镜而可以与多种其他技术相结合,例如微操作,微分干涉成像系统,光镊技术,扫描探针显微术等等,因而相对于棱镜型展现出更加广阔的生物应用前景。

3. 物镜型光学成像系统中物镜

由于细胞的典型折射率为1.33~1.38,因此要实现全内反射,在物镜型全内反射荧光成像系统中物镜的数值孔径(NA必须大于1.38。表达式为

NA=nsinθ; nsinθ>nsinθc (3 其中NA为物镜的数值孔径,n,θ分别为物镜的折射率(浸没油和孔径角。θc为发生全内反射的临界角。当物镜数值孔径为1.4时,只有很小的一部分数值孔径范围(1.4-1.38=0.02被利用,入射角可调节范围(最大孔径角与全内反射角的差值很小,光束校准比较难,同时光束的强度也很难提高。若使用数值孔径为 1.65的物镜,则有一个大的多的孔径范围(1.65-1.38=0.27可以被利用,则入射角可调节范围变大,降低了操作难度。高数值孔径的物镜的使用是物镜型全内反射荧光成像系统的关键[2,4]。

表1:全内反射角和最大的物镜角