分解纤维素的微生物的分离

专题二 课题3：分解纤维素的微生物的分离

一、基础知识 ㈠ 纤维素与纤维素酶 1.纤维素

（1）单位： 。 （2）形成方式： ，要脱下 。

（3）本质：一种由 首尾相连而成的高分子化合物，是含量最丰富的多糖类物质。

（4）存在：植物的根、茎、叶等器官都含有大量的纤维素。其中 是自然界中纤维素含量最高的天然产物。 （5）含量：纤维素是地球上含量最丰富的多糖类物质，植物每年产生的纤维素超过70亿吨，其中 能被土壤中能产生纤维素酶的微生物所利用，不会大量积累。 （6）作用：组成细胞壁，作植物的骨架。 2.纤维素酶

纤维素酶是一种 ，一般认为它至少包括 组分，即 (外切酶)、 (内切酶)和 ，前两种酶使纤维素分解成纤维 ，第三种酶将纤维二糖分解成 。

思考1：草食性动物是怎样消化食物中纤维素的？

答：肠胃中的 微生物。能产生纤维素酶而分解纤维素。 纤维素酶的作用对照实验

试管 滤纸条 缓冲液 纤维素酶 振动 现象 甲 1cm x 6cm 10ml / 1h 分解 乙 1cm x 6cm 11ml 1ml 1h 不分解

1U表示1个酶活力单位，是指在温度为25℃，其他反应条件，如pH等均为最适的情况下，在1min内转化1mmol的底物所需的酶量。 思考2：乙试管的滤纸条为什么会消失？

答：本实验的自变量是纤维素酶的有无，自变量的操作方法是：在一支试管中添加适量（1mL）的纤维素酶溶液，在另一支试管不添加纤维素酶，但需加入等量的缓冲液，不能加入蒸馏水，否则会影响溶液的pH。 （二）纤维素分解菌的筛选 1、刚果红染色法

（1）刚果红（ ）能的作用

是一种 ，与纤维素形成 复合物，而不与水解后的纤维二糖和葡萄糖发生这种反应。 （2）染色原理

当在含有纤维素的培养基中加入刚果红时，刚果红能与培养基中的纤维素形成 。当纤维素被纤维素酶分解后，刚果红--纤维素的复合物就无法形成，培养基中就会出现以纤维素分解菌为中心的 ，可通过是否产生透明

圈来筛选 。

例3：纤维素分解菌的筛选方法？透明圈越大，纤维素分解菌越多？ 答： 。 二、实验设计

思考4：本实验的流程与课题2中的实验流程有哪些异同？

答：课题2是将土样成的菌悬液直接涂布在以尿素为 氮源的选择性培养基上，直接分离得到菌落。 本课题通过选择培养，使纤维素分解菌得到增殖后，再将菌液涂布在选择培养基上。其他步骤基本一致。 1、土壤取样

① 分布环境：富含 的环境中。 原因：在富含纤维素的环境中纤维素分解菌的含量相对提高 ②实例：树林中多年落叶形成的腐殖土，多年积累的枯枝败叶等 思考5：为什么要在富含纤维素的环境中寻找纤维素分解菌？

答：生物与环境的互相依存关系，在富含纤维素的环境中纤维素分解菌的含量相对提高，因此从这种土壤中获得目的微生物的几率要高于普通环境

思考6：如果找不到合适的环境，可以将滤纸埋在土壤中，将滤纸埋在土壤中有什么作用？你认为滤纸应该埋在土壤中多深？

答：将滤纸埋在土壤中能使纤维素分解菌相对集中，实际上是人工设置纤维素分解菌生存的适宜环境。一般应将滤纸埋于深约 cm左右的土壤中， 天后可用。 2、选择培养

① 目的： ，确保从样品中分离所需微生物 ② 制备选择培养基

培养基组成 纤维素粉 5g NaNO3 1g KCl 0.5g Na2HPO4·7H2O 1.2g KH2PO4 0.9g MgSO4 ·7H2O 0.5g 酵母膏 0.5g 水解酵素 0.5g 溶解后，蒸馏水定容至1000mL 思考7：旁栏中的配方是液体培养基还是固体培养基？为什么？

答：是 培养基，原因是配方中无 。 思考8：这个培养基对微生物是否具有选择作用？如果具有，是如何进行选择的？

提供主要的营养物质 碳源（能源） 氮源、无机盐 无机盐 生长因子、碳源、氮源 氮素、生长因子 水 答：有 作用，本配方中纤维素作为主要碳源，只有能分解 的微生物可以大量繁殖。

思考9：你能否设计一个对照实验，说明选择培养基的作用

答：自变量为培养基的种类，即普通培养基和选择培养基。可用牛肉膏蛋白胨培养基与之对照,或者将纤维素改为葡萄糖。

说明：该配方中的酵母膏也能够提供少量的碳源，因此其他微生物也能在该培养基中生长繁殖。只不过，由于酵母膏的含量极少，因此，只有以纤维素为碳源的微生物才能大量繁殖。 ③ 操作方法：

将土样加入装有30ml选择培养基的锥形瓶中，将锥形瓶固定在摇床上，在一定温度下震荡培养1～2天，直至培养液变浑浊。也可重复选择培养。

思考10：为什么选择培养能够“浓缩”所需的微生物？

答：在选择培养的条件下，可以使那些能够适应这种营养条件的微生物得到迅速繁殖，而那些不适应这种营养条件的微生物的繁殖被抑制，因此可以起到“浓缩”的作用。 3. 刚果红染色法

挑选产生透明圈的菌落，一般即为分解纤维素的菌落。 方法一：先 ，再加入刚果红进行颜色反应。 方法二：在 时就加入刚果红。 思考12：这两种方法各有哪些优点与不足？ 步骤 方法一： 培养基经涂布培养先长出菌落→再覆盖1mg/mL的CR溶液→(10~15min后)倒去CR溶液→加入1mol/L的NaCl溶液→15min后倒掉NaCl溶液→出现透明圈 优点 缺点 显示出的颜色基本上是纤维素分解菌的作用 操作繁琐，加入刚果红会使菌落之间发生混杂 操作简便，不存在菌落的混杂问题 ①由于产生淀粉酶的微生物也形成透明圈，所以可能产生假阳性反应。 ②有些微生物具有降解色素的能力，他们在培养过程中也会形成明显的透明圈，与纤维素的分解菌不易区分。 思考13：方法一中NaCl溶液的作用？

答： 作用，洗去与纤维素结合不牢的刚果红，以免出现的透明圈不够清晰。 4.梯度稀释

将选择培倍。

器具：移液管、酒精灯、试管、棉花塞

灭菌：试管口和移液管在离火焰 cm。

注意：每次用移液管吸取1ml培养液时，要吹吸三次，使菌液与水充分 。 5.将样品涂布到鉴别纤维素分解菌的培养基上

养后的培养基进行等比稀释

方法二： 配置10mg/mL的CR溶液→灭菌→按照1mLCR溶液/200mL培养基的比例混匀→倒平板→接种后培养→出现透明圈 （1）制备鉴别培养基

鉴别纤维素分解菌的培养基

培养基组成 CMC-Na (水溶性羧甲基纤维素钠)5--10g 酵母膏 1g KH2PO4 0.25g 土豆汁 100mL 琼脂 15g 上述物质溶解后，加蒸馏水定容1000mL （2）涂布平板：

将稀释度为10～10的菌悬液各取0.1ml涂布在培养基上，30℃倒置培养。 （3）挑选产生透明圈的菌落

分解尿素的细菌与纤维素分解菌的鉴定培养的比较

项目 原理 培养 类型 目的 细菌合成的脲酶将尿素分解成了氨，氨会使培原理 鉴 定 现象 观察菌落周围是否有着色的 环带出现来鉴定尿素分解菌 观察菌落周围是否出现 透明圈来筛选纤维素分解菌 养基的碱性增强，pH升高。在培养基中加入酚红指示剂，如果pH升高指示剂会变红 刚果红与纤维素形成红色复合物，当纤维素被纤维素酶分解后红色复合物无法形成，培养基上就会出现以纤维素分解菌为中心的透明圈 分解尿素的细菌 纤维素分解菌 4

6

提供的主要营养物质 碳源 碳源、氮源、生长因子 无机盐 碳源、生长因子 凝固剂 氢元素、氧元素

将细菌涂布在只有尿素做氮源的选择培养基上 方法 6、纯化培养

在产生明显的透明圈的菌落，挑取并接种到纤维素分解菌的 上，在300C－ 370C培养，可获得纯化培养

五、课题延伸

本课题对分解纤维素的微生物进行了初步的筛选，但是这只是分离纯化的第一步。为确定得到的是纤维素分解菌，还需要进行发酵产纤维素酶的实验，纤维素酶的测定方法一般是对纤维素酶分解滤纸等纤维素后所产生的葡萄糖进行定量的测定。

1、为了确定分离得到的是纤维素分解菌，还需要进行 实验，纤维素酶的发酵方法有 发酵和 发酵。

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