生物化学实验教案

实验五 血糖的定量测定（葡萄糖氧化酶法）

[实验目的及要求]

掌握葡萄糖氧化酶法测定血糖含量的原理和方法。 [实验原理]

??D-葡糖糖???D-葡萄糖酸+ H2O2 ???? GOD H 2 O2+4-AAP+苯酚 POD [实验仪器及试剂]

试管、移液管、UNICO-2000型分光光度计、恒温水浴锅。

酶试剂：葡萄糖氧化酶（GOD）、过氧化物酶（POD）、4-氨基安替吡啉（4-AAP）。 酚试剂：苯酚。

标准葡萄糖溶液：100 mg/dL (5.55 mmol/L)。 [实验步骤]

按下表加入各反应物：

加入物（ml） 葡萄糖标准液 血清样品 酶试剂 酚试剂 空白管 —— —— 1.50 1.50 标准管 0.020 —— 1.50 1.50 测定管 _____ 0.020 1.50 1.50 红色醌化物+H2O

混匀，37℃保温15min，以空白管调零，505nm波长处测定各管吸光度值。 计算 血糖含量=A样/A标×标准溶液浓度 [实验注意事项]

1. 分离血清要求使用未溶血样品，否则测定结果偏大。 2. 要求在30 min内分离血清，糖酵解在全血中以7%/h进行。 3. 样本在4℃-8℃可稳定24h,样本放置时间过长会使结果偏低。

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实验六 人血清中总胆固醇的测定

[实验目的及要求]

学会利用氧化酶法测定血清中总胆固醇含量的原理和方法。 [实验原理]

胆固醇脂+H2O 胆固醇+游离脂肪酸

CEH

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胆固醇+O2 CHOD ⊿-胆甾烯酮+H2O2 2H2O2+4-AA+4-氯仿 POD 醌亚胺（红色）+4H2O CEH：胆固醇脂酶 POD：过氧化物酶 CHOD：胆固醇氧化酶 4-AA：4-氨基安替吡啉

醌亚胺在500nm有特征吸收，且生成量与样本中的胆固醇含量成正比，可通过测定标准品反应生成的醌亚胺的吸光度值，计算出样本中胆固醇的浓度。 [实验仪器及试剂]

试管、移液管、UNICO-2000型分光光度计、恒温水浴锅。 标准血清、样本血清、蒸馏水、酶试剂盒。 [实验步骤]

按下表加入各反应物：

?l 酶试剂 蒸馏水 标准血清 样本血清 A500nm 空白管 标准管 样本管 2000 20 _____ _____ 2000 ____ 20 _____ 2000 _____ _____ 20 各管混匀，37℃反应6 min，以空白管校零。

A样本 胆固醇含量= A标准 ×标准血清浓度

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实验七 牛奶中粗脂肪含量的测定

[实验目的及要求]

学习和掌握粗脂肪的定量测定法─索氏提取法。 [实验原理]

本实验用重量法，利用脂肪能溶于脂溶性溶剂这一特性，用脂溶性溶剂将脂肪提取出来，借蒸发除去溶剂后称量。整个提取过程均在索氏提取器中进行。通常使用的脂溶性溶剂为乙醚或沸点为30oC -60 oC的石油醚。用此法提取的脂溶性物质除脂肪外，还含有游离脂肪酸、磷脂、固醇、芳香油及某些色素等，故称为“粗脂肪”。

索氏提取器 (如图所示)利用溶剂回流及虹吸原理，使固体物质连续不断地被纯溶剂萃取，既节约溶利萃取效率又高。萃取前先将固体物质研碎，以增加固液接触的面积。然后将固体

物质放在滤纸套内，置于提取器中，提取器的下端与盛有溶剂的圆底烧瓶相连，上面接回流冷凝管。加热圆底烧瓶，使溶剂沸腾，蒸气通过提取器的支管上升，被冷凝后滴入提取器中，溶剂和固体接触进行萃取，当溶剂面超过虹吸管的最高处时，含有萃取物的溶剂虹吸回烧瓶，因而萃取出一部分物质，如此重复，使固体物质不断为纯的溶剂所萃取，将萃取出的物质富集在烧瓶中。 [实验仪器及试剂]

索氏提取器、干燥箱、电子分析天平、滤纸、棉线、干燥器、烘箱。 全脂牛奶、无水乙醚或石油醚。 [实验内容及步骤]

1、牛奶中水分含量的测定

准确称取一定量牛奶，吸附于70℃过夜烘干的层析滤纸上，70℃烘干后（约20分钟）称量，计算水分含量。

水分含量%=（M牛奶-M干物质）/M牛奶×100% M干物质=M带有干物质的层析滤纸-M层析滤纸 2、牛奶中粗脂肪含量的测定

将洗净的索氏提取器小烧瓶用铅笔在磨口处编号，103-105℃烘干2小时，取出，置于干燥器中冷却，然后用电子分析天平称重，并记录。将测完水分含量带有干物质的层析滤纸用定性滤纸包裹，称量后置索氏抽提瓶，连接已干燥至恒重的脂肪接受瓶，由冷凝管上端加入无水乙醚，加量为接受瓶的2／3体积，恒温水浴加热，控制水温，以每小时回流3-5次为宜至抽提完全为止（用滤纸试）。

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取下接受瓶，在水浴上蒸干乙醚，再于100℃～105℃干燥 2小时，取出放干燥器内冷却30分钟，称重，重复操作至恒重。取出滤纸包，于户外晾至无乙醚味，置入恒温箱内，烘干，然后移入干燥缸内冷却后称重，重复操作至恒重。

计算 ：（1）粗脂肪含量%=（M提取前纸包-M提取后纸包）/M干物质×100%

（2）粗脂肪含量%=（M接受瓶+粗脂肪-M接受瓶）/M干物质×100%

[注意事项]

1、乙醚为易燃有机溶剂，实验室应保持通风并禁止任何明火。

2、抽提用的乙醚或石油醚要求无水、无醇、无过氧化物，挥发残渣含量低。因水和醇可导致水溶性物质溶解，如水溶性盐类、糖类等，使得测定结果偏高，被测样品也要事先烘干。过氧化物会导致脂肪氧化，在烘干时也有引起爆炸的危险。

3、装样品的滤纸筒一定要严密，不能往外漏样品，但也不要包得太紧影响溶剂渗透。放入滤纸筒时高度不要超过回流弯管，否则超过弯管的样品中的脂肪不能提尽，造成误差。

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