食品微生物的检测、分离纯化和初步鉴定

［5］ 加棉塞：培养基分装完毕后，在试管口或三角瓶口塞上棉塞，以阻止

外界微生物进入培养基内而造成污染，并保证有良好的通气性能，然后包扎一层报纸。试管应先捆成一捆后再于棉塞外包扎报纸，贴上标签，注明培养基名称、日期、组别。 1.4.2.2 无菌水的制备。

用移液管取9mL蒸馏水于6支小试管中，塞上棉塞，包扎报纸。 1.4.2.3 器皿的准备。 ［1］ 玻璃仪器初步清洗 ［2］ 培养皿的包装：每10套一包，用旧报纸包扎。 ［3］ 移液管的包装：首先在吸管的上端塞上一小段棉花，用长纸条包扎、

打结。 ［4］ 玻璃涂布棒的包装：方法同移液管的包装。 1.4.2.4 高压灭菌。

将所要灭菌物品放入高压蒸汽灭菌锅内，根据需要设定灭菌温度和时间121℃，20min灭菌（MRS培养基中含有葡萄糖等成分，灭菌温度和时间分别为113 ℃，30min）。

1.4.2.5 倒平板：在超净工作台将培养基冷至50℃左右，点燃酒精灯，在

火焰旁倒平板。

1.4.2.6 微生物的分离与纯化。 ［1］ 稀释平板分离法：

将5支4ml的无菌水试管排列好，按10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、-6

10依次编号。在无菌操作条件下，用1ml的无菌移液管吸取1ml菌悬液置于第一支试管中，持移液管吹洗三次，用手摇1分钟将颗粒状样品打散。即为1/10浓度的菌液。用l毫升无菌移液管吸取lml 1/10

-2

浓度的菌液于第二支试管，将移液管吹洗三次，摇匀即为10浓度菌液。同样方法，依次稀释到10-3。稀释过程如图

［2］ 平板的制作

取6套无菌培养皿编号1、2、3、4、5、6，吸取0.5mL菌液于相应编号的培养皿内加热融化培养基，当培养基冷至45℃左右时，右手拿装有培养基的锥形瓶，左手拿培养皿，以中指、无名指和小指托住皿底，拇指和食指夹住皿盖．靠近火焰，将皿盖掀开，倒入培养基后将培养皿平放在桌上，顺时针和反时针来回转动培养皿，使培养基

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和菌液充分混匀，冷凝后即成平板，倒置于30℃培养24～48h，然后观察结果。 ［3］ 稀释平板涂布法：

由于实验的目的、所研究的微生物种类、所用的培养基及容器的不同，因此，接种方法也有多种，如斜面接种技术 、液体培养基中的菌种被接入液体培养基、液体接种 、穿刺接种、稀释平板涂布法等 。本实验中采用稀释平板涂布法。

稀释平板涂布法与稀释平板法、平板划线法的作用一样，都是把聚集在一起的群体分散成能在培养基上长成单个菌落的分离方法（此法接种量不宜太多，只能在0.5ml以下）。培养时起初不能倒置，先正摆一段时间等水分蒸发后倒置。

分别将培养好的细菌、真菌进行平板分离。分别在适宜温度培养，本实验所用的培养箱的温度是35℃。 ［4］ 菌种保藏（老师视频示范）： 1.4.2.7 分离菌株的鉴定。 ［1］ 观察菌种A、B、C、D、E的培养特征。 ［2］ 细菌的革兰氏染色，记录菌体特征与染色特性。

I 制片：制片方法与简单染色相同。 II 初染：加适量（以刚好覆盖菌为宜）的结晶紫染色液染色1.5min，

水洗。

III 媒染：碘液媒染1min，水洗。 IV 脱色：连续滴加95%乙醇脱色20—30s至流出液无色，立即水洗。 V 复染：滴加番红复染1.5min，水洗。 VI 晾干：将染色好的涂片放空气中晾干，用吸水纸吸干载 玻片上

的水。

VII 镜检：镜检时先用低倍，再用高倍，最后用油镜观察，并判断菌

体的革兰氏染色反应性。

VIII 实验完毕后的处理：

① 将浸过油的镜头按下述方法擦干净，A先用擦净纸将油精头上的油擦去。B用擦镜纸沾少许二甲苯将镜头擦2～3次。C再用干净的擦镜纸将镜头擦2～3次。注意擦镜头是向一个方向擦拭。

② 看后的染色玻片用废纸将香柏油擦干净。

［3］ 细菌的芽孢染色。

I 制片：按常规方法涂片、干燥及固定。

II 加热染色：向载玻片滴加数滴5%孔雀绿水溶液覆盖涂菌部位，

用夹子夹住载玻片在微火上加热染液冒蒸气计时并维持5min，加热时注意补充染液，切勿让涂片干涸。

III 脱色：待玻片冷却后，用缓流自来水冲洗至流出水无色为止。 IV 复染：用0.5%番红水溶液复染2min。

V 水洗：用缓流自来水冲洗至流出水无色为止。

VI 镜检：镜检时先用低倍，再用高倍，最后用油镜观察芽孢和菌体

的形态。

结果：芽孢呈绿色，菌体呈红色。

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［4］ 进行以下细菌的生理生化试验：

I 淀粉水解试验

① 将固体淀粉培养基溶化后冷却至50℃左右，无菌操作制成平

板。

② 用记号笔在平板底部划成4个部分。

③ 将选取的各菌分别在不同的部分点一下，在平板的反面分别

在4个部分标明所接种细菌。

④ 将平板倒置在37℃温箱中培养24h。

⑤ 观察各种细菌的生长情况，打开平板盖子，滴入少量卢戈氏

碘液于平板中，轻轻旋转平板，使碘液均匀铺满整个平板。 如菌苔周围出现无色透明圈，说明淀粉已被水解，为阳性。根据透明圈的大小可初步判断该菌水解淀粉能力的强弱，即产生胞外淀粉酶活力的高低。 II 糖发酵试验

① 葡萄糖发酵；②淀粉发酵。

取葡萄糖发酵管与乳糖发酵管各3支，标记，接种，37℃培养24-48h。 III IMVIC试验

接种于2支葡萄糖蛋白胨培养基，37℃培养48h；

① MR试验：取一种细菌的24h培养物，接种于葡萄糖蛋白胨水培养基中，置37℃培养48～72h，取出后加甲基红试剂3～5滴，观察结果。。

② VP试验：取一种细菌的24h纯培养物，接种于葡萄糖蛋白

胨水培养基中，置37℃培养48～72h取出后在培养液中先加40%KOH溶液0.4ml，再加5%α-萘酚溶液0.4ml，充分混匀。静置在试管架上，15min后观察结果。

2实验原始记录

实验原始数据

表一 水被稀释培养后的菌数

稀释倍数

10-1 >300

10-2 46

10-3 17

10-4 11

10-5 -

10-6 -

菌落数

表二 淀粉水解试验结果 菌 种 样 品 ： 水 实验现象 - 7

A

B C D E

- - + -

称为试验阳性；否则，记为“-”，称为试验阴性。

符号说明：在平板上滴加卢戈氏碘液呈蓝色，而菌落周围如有无色透明圈出现，记为“+”，

表三 糖发酵试验结果 样 品 实验现象 ： 菌 水 葡萄糖发酵 种 乳糖发酵 - - - -

A B C D E

+ + + + +

⊕

符号说明：“⊕”表示产酸产气； “+”表示产酸不产气，称试验阳性；否则记为“-”，

称试验阴性，表示不产酸和不产气。

表四 MR试验和VP试验结果 菌 种 A B C D E 样 品 : 水 实验现象 MR试验 VP试验 + - - - + + + + + + 符号说明： 置于冰箱30min,取出后立即倾斜试管，观察试管培养基的状态， 若部分或全部呈液化状态，记为“+”，称为试验阳性，培养基变红色；否则，记为“-”，称为试验阴性，培养基变黄色。

表五 芽孢试验结果 菌 A B C D E 种 样 品 ： 水 实验现象 - - - + + 符号说明：试验菌有芽孢记为“+”；否则记为“-”。

表六 显微镜观察和革兰氏染色试验结果

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