蔗糖酶

根据记录仪所出的峰，分别合并每个峰顶周围的2～3管，进行蔗糖酶活力测定，以确定样品峰，然后对样品峰进行合并，PEG2 000浓缩为1ml（该溶液为柱级分IV），置4℃保存。

3.1.2.6 结果处理

1）在同一张图上画出所有管的酶活力，NaCl浓度（可用电导率代替）和光吸收值A280的曲线和洗脱梯度线。

2）根据从收集管中所取样品的检测结果，进行目标峰的判定。

【注意事项】

1）柱材料处理时最好采用真空泵抽滤的方法，不推荐选用静置弃上清，防止材料损失严重。 2）装柱时注意连续装柱，防止柱材料沉淀不均匀。

3）上样前样品须离心，并且在柱床表面需加上一同样大小的滤纸。防止样品残渣堵塞层析柱。

【思考题】

1）离子交换层析的原理。

离子交换层析是根据蛋白质所带电荷的差异进行分离纯化的一种方法。蛋白质的带电性是由蛋白质多肽中带电氨基酸决定的。由于蛋白质中氨基酸的电性又取决于介质中的pH，所以蛋白质的带电性也就依赖于介质的pH。当pH较低时，负电基团被中和，而正电基团就很多; 在pH较高时，蛋白质的电性与低pH时相反。当蛋白质所处的pH，使蛋白质的正负电荷相等，此时的pH称为等电点。离子交换层析所用的交换剂是经酯化、氧化等化学反应引入阳性或阴性离子基团制成的，可与带相反电荷的蛋白质进行交换吸附。带有阳离子基团的交换剂可置换吸附带负电荷的物质，称为阴离子交换剂，如DEAE-纤维素树脂;反之称为阳离子交换剂，如CM-纤维素树脂。不同的蛋白质有不同的等电点，在一定的条件下解离后所带的电荷种类和电荷量都不同，因而可与不同的离子交换剂以不同的亲和力相互交换吸附。当缓冲液中的离子基团与结合在离子交换剂上的蛋白质相竞争时，亲和力小的蛋白质分子首先被解吸附而洗脱，而亲和力大的蛋白质则后被解吸附和洗脱。因此，可通过增加缓冲液的离子强度和/或改变酸碱度，便可改变蛋白质的吸附状况，使不同亲和力的蛋白质得以分离。

2）离子交换有那些类型，各有何用途？

类型：

离子交换树脂可分为阳离子交换树脂、阴离子交换树脂和两性离子交换树脂。若带有酸性功能基，能与溶液中的阳离子进行交换，称为阳离子交换树脂；若带有碱性功能基，能与阴离子进行交换，则称为阴离子交换树脂。两性树脂是一类在同一树脂中存在着阴、阳两种基团的离子交换树脂，包括强酸-弱碱型、弱酸-强碱型和弱酸-弱碱型。 使用方法： 1、热水洗涤

准备使用的新树脂先用热水反复清洗。阳树脂可用70～80℃的热水，阴树脂（特别是强碱阴树脂）的耐热性较差，可用50～60℃的热水。开始浸洗时，每隔15分钟左右换水一次，浸洗时要不是搅拌，换水4～5次后，可隔30分钟左右换水一次，总共换水7～8次，浸泡至洗涤水不带褐色，泡沫很少时为止。 2、酸、碱处理

树脂用热水洗涤后装填进柱，再用酸、碱处理。阳树脂用1mol/1HCL缓缓流过树脂层，用量约为树脂体积的2～3倍，约2小时流完，用水稍淋洗后，再用1mol/1NaOH流过树脂层，用量和流速同前。碱流完后，用水淋洗至出水ph9左右，再用1mol/1HCL或0.5mol/1H2SO4将树脂转成H+型，用量为树脂体积的3～4倍，流速与前同。酸流完后，用水淋洗至出水ph6以上时，即可投入运行。

3.1.3 蔗糖酶各级分活性及蛋白质含量的测定

3.1.3.1 目的

学习蔗糖酶活性测定和酶分离纯化各个步骤可行性以及分离纯化效果的评价方法。

3.1.3.2 原理

为了测定各级分中酶活力大小和比活，计算出各纯化步骤的纯化倍数，从而对之进行评价。该实验中酶活力定义为一定时间内催化反应生成的还原糖的量，比活力为每毫克蛋白样品的酶活力大小。

测定还原糖的方法有许多种，如费林试剂法、Nelson’s试剂法、水杨酸试剂法等，

Nelson’s试剂法中涉及到有毒试剂的使用。而费林试剂法灵敏度较高，但数据波动较大，反应后溶液的颜色随时间会有变化，因此加样和测定光吸收值需要严格计时。通过对种种方法的比较研究，认为水杨酸试剂法相对较为稳定。

本实验使用水杨酸试剂法测定反应中还原糖的生成量，从而确定各级分中蔗糖酶的活力大小。其原理是在碱性条件下，蔗糖酶催化蔗糖水解，生成一分子葡萄糖和一分子果糖。这些还原性糖作用于黄色的3，5－二硝基水杨酸，生成棕红色的3－氨基－5硝基水杨酸，还原糖本身被氧化成糖酸及其他产物。生成的棕红色3－氨基－5硝基水杨酸产物颜色深浅的程度与还原糖的量成一定的比例关系，在540nm波长下测定棕红色物质的吸光值，查对标准曲线并计算，便可求出样品中还原糖的量。

3.1.3.3 试剂和材料

1）0.4mol/L 氢氧化钠

2）3，5－二硝基水杨酸 精确称取1g 3，5－二硝基水杨酸溶于20 ml 1mol/L氢氧化钠中，加入50ml蒸馏水，再加入30g酒石酸钾钠，待溶解后用蒸馏水稀释至100ml，盖紧瓶盖，防止CO2进入。

3）0.25%苯甲酸200ml配葡萄糖用，防止时间长溶液长菌，也可以用去离子水代替。

4）葡萄糖标准溶液

精确称取无水葡萄糖（应在105℃恒重过）0.36克，以0.25%苯甲液溶解后，定容到100ml容量瓶中（浓度20nmol/L）。

5）0.2mol/L蔗糖溶液50ml分装于小试管中冰冻保存，因蔗糖极易水解，用时取出一管化冻后摇匀。

6）0.2mol/L乙酸缓冲液，pH4.9，200ml。

7）牛血清白蛋白标准溶液（200μg/ml，精确配制50ml）。

8）考马斯亮兰G-250染料试剂100mg考马斯亮兰G-250全溶于50ml 95%乙醇（V/V）后，加入120ml 85%磷酸，用去离子水稀释到1L。

3.1.3.4 仪器

1）试管，试管架 2）定时器 3）移液管 4）比色杯 5）水浴锅 6）电炉

3.1.3.5 操作步骤

1）各级分蛋白质含量的测定 （1）标准曲线的制作

采用考马斯亮蓝G-250法测定蛋白质含量，取不同体积牛血清白蛋白标准溶液（200μg/ml），用蒸馏水配成一定的梯度溶液，与考马斯亮蓝G-250显色后在595nm测定其吸光度，以吸光度A595对蛋白质含量作标准曲线，具体如下：

管号

牛血清白蛋白（ml） 牛血清白蛋白（μg）

H2O(ml) 考马斯亮蓝G-250(ml)

A595

0 0 0 1.0 5

1 0.1 20 0.9 5

2 0.2 40 0.8 5

3 0.3 60 0.7 5

4 0.4 80 0.6 5

5 0.5 100 0.5 5

6 0.6 120 0.4 5

7 0.7 140 0.3 5

8 0.8 160 0.2 5

9 0.9 180 0.1 5

10 1.0 200 0.0 5

（2）各级分蛋白质含量的测定

各级分先要仔细寻找和试测出合适的稀释倍数，下列稀释倍数仅供参考。 粗级分 I： 5～10倍 热级分II： 5～10倍 醇级分III： 10～20倍 柱级分IV： 20～40倍

确定了稀释倍数后，按照下表加入各试剂, 进行样品测定，然后参照标准曲线计算出各级分蛋白质浓度。 管号

0

级分Ⅰ 1 2 3 1 1 1 0 0 0

4

1 0

级分Ⅱ 5 6 1 1 0 0

级分Ⅲ

7 8 9 1 1 1 0 0 0

级分Ⅳ

10 11 12 1 1 1 0 0 0

酶液（ml） 0

水 1

加入考马斯亮蓝G-250各5ml，混匀后静置2min后在595nm测吸光值

A595 平均值

2）还原糖测定方法

采用水杨酸试剂显色法，通过测定反应后样品中还原糖的量来确定酶活力。 （1）标准曲线的制作 取不同体积的葡萄糖标准液（20nmol/L）,用蒸馏水配成一定的梯度溶液，与水杨酸试剂显色后在540nm光下测定其吸光度，以吸光度A540对葡萄糖浓度作标准曲线，具体如下：

管号 20nm葡萄糖（ml） 葡萄糖 （μmol） H2O(ml) 水杨酸试剂

(ml)

A540

（2）级分I、II、III、IV酶活力大小的测定

用0.02mol/L pH4.9乙酸缓冲液（也可以用pH5～6的去离子水代替）稀释各级分酶液，试测出各级分合适的稀释倍数。 I 10～20倍 II 10～20倍 III 100～200倍

IV 100～200倍 以上稀释倍数仅供参考。

按下表的顺序在试管中加入各试剂，进行测定，

各管名称 管号 酶液(ml) H2O(ml) 乙酸缓冲液 (0.2mol/L pH4.9) 葡萄糖20nmol/L 蔗糖0.2mol/L 0.4mol/L NaOH 0.2mol/L 蔗糖 对照 1 2 级分Ⅰ--IV 3----14(每个级分三个重复) 葡萄糖 15 16 0 0.0 0 1.0 2

1 0.1 2 0.9 2

2 0.2 4 0.8 2

3 0.3 6 0.7 2

4 0.4 8 0.6 2

5 0.5 10 0.5 2

6 0.6 12 0.4 2

7 0.7 14 0.3 2

8 0.8 16 0.2 2

9 0.9 18 0.1 2

10 1.0 20 0.0 2

沸水浴5 min,流水冷却，定容至25 ml

0.0 0.6 / / 0.6 0 1.0 0.8 0.2 0.2 / / / / / 0.2 0.2 0.2 / / 1 / / / / 0.2 0.2 / / 加入蔗糖，立即摇匀开始计时，室温准确反应10min,反应后向3—14试管中加入NaOH终止反应 3，5－二硝基水杨酸试剂 2.0 2.0 2.0 沸水浴加热5min，立即用自来水冷却。用H2O定容至25ml