血栓心脉宁片激活Nrf2及其下游基因

血栓心脉宁片激活Nrf2及其下游基因

可能与血栓心脉宁片在HUVECs中的抗氧化活性相关

吉林大学基础医学院病原生物学系 熊凌锌 谢婧书 宋晨雪 郑敬彤 张晓天 王放 吉林大学药学院 刘金平 刘传贵 李平亚

流行病学研究表明,抗氧化活性在保护血管内皮细胞中扮演重要角色。本试验的目的在于研究传统中药血栓心脉宁片（XXT）的抗氧化活性和Nrf2（转录因子NF-E2 相关因子）调控基因的差异性表达。结果表明,XXT 可强烈激活Nrf2 及其下游调控基因，这可能与XXT 的抗氧化活性及血管内皮细胞的保护活性相关。

前言

十多年来，因XXT可促进血液循环、去除血瘀，在中国被广泛应用于脑血栓和冠心病的治疗。氧化与包括高血压、高胆甾醇血症在内的所有的心脑血管疾病有关，可通过激活产生活性氧（ROS）的NADPH 氧化酶参与这些疾病的形成。因此，我们研究XXT的体外抗氧化活性。

Nrf2系统被认为是一种主要的抗氧化保护机制，在细胞防御中发挥作用，也可通过激活编码Ⅱ期解毒酶和抗氧化酶的基因促进ROS的去除。通常条件下，Nrf2与可结合肌动蛋白的Keap1 结合，二者形成Keap1-Nrf2 复合体。这种复合体可阻止Nrf2进入细胞核，促进其蛋白酶降解。当用包括H2O2在内的氧化物刺激细胞时，氧化应激和构象变化可作为硫醇敏感型氨基酸的氧化结果，并驱使Nrf2与Keap1分离。随后Nrf2转移至细胞核，结合ARE靶基因的抗氧化反应成分（ARE），导致抗氧化酶表达上调。

在本试验中，我们旨在研究可控制抗氧化基因和ROS 的Nrf2 及其下游基因的转录调控，并研究XXT的抗氧化活性是否受Nrf2的调控。

研究方法

细胞培养和用药

在加15%胎牛血清的IMDM培养基中培养人脐静脉内皮细胞（HUVECs）（37℃、

5%CO2）。测试期培养基用含2?S的IMDM换液。将所培养的细胞分为5组：对照组（NC）、氧化应激模型组（Model）、三个XXT加药组（包括高剂量组（200 μg/ml）、中剂量组（100 μg/ml）和低剂量组（50 μg/ml）。NC组细胞用0.2 mM H2O2处理4h，XXT加药组细胞在H2O2 处理24h 前用XXT（200、100、50 μg/ml）预处理。

H2O2的浓度根据H2O2的IC50 确定，但XXT 的浓度根据筛选研究确定。用MTT法评估细胞存活。 细胞内ROS 水平的检测

用ROS 试剂盒检测HUVECs细胞中的ROS水平。为了检测ROS水平，加药20 min后将HUVECs于37℃黑暗环境中的10μM DCFH-DA 孵育。随后流式检测细胞。 氧化应激PCR Array

用人源氧化应激PCR Array检测84种氧化相关基因的表达。用RNeasy Mini Kit 将HUVECs的总RNA提取，用UNIC 2800 UV/VIS 分光光度计检测波长为260nm和280 nm时的吸光度，从而评估RNA 提取物的量。用RNase-FreeDNase Set纯化总RNA，并用RT2 Fist Stand Kit进行逆转录反应，获得cDNA，使用RT2 SYBR GreenROX qPCR Mastermix 进行PCR 反应。用ABIPrism SDS 7300 system进行热循环。用Ct值比较不同组的基因表达，所得数值用△△Ct 法计算（将五种常见基因（ACTB、B2M、GAPDH、HPRT 和RPL13A）的平均表达水平正态化。 Real-Time PCR

如先前描述的那样，用RNeasy Mini Kit 将HUVECs的总RNA提取，用分光光度计检测RNA提取物的量。将总RNA 用PrimeScript RT ReagentKit 和gDNA Eraser 转录。用Real-Time PCR 和SYBR Premix Ex Taq 检测cDNA。用ABI Prism SDS7300 system进行热循环。如先前描述的那样，用Ct值比较不同组的基因表达。

Western Blotting

加药后收集细胞，并在RIPA 缓冲液裂解细胞。每条带25 μg蛋白负载至SDS-PAGE 胶上，转膜至硝化纤维素膜。随后封闭膜，用靶蛋白（β-actin、Nrf2、Keap1、GCLM、NQO1 和HMOX1）相对应的抗体检测，并用合适的二抗孵育2h。加染色溶液混合物，曝光后检测免疫反应条带。 数据分析

数据用平均值±标准差表示，并用t 检验分析数据。P<0.05 表示数据有显著差

异。三组间数据的比较用单因素ANOVA 分析，qPCR 结果用非参数Mann-WhitneyU数据检测法分析。以上的分析过程用SPSS 软件操作。

结果

H2O2可剂量依赖性诱导细胞毒性

用不同浓度XXT处理HUVECs 细胞4 h，并检测氧化应激。结果表明：加H2O2会导致剂量依赖性氧化应激。加0.2 mM 后会使细胞数量减少51.74% （图1）。因此此浓度可以作为HUVECs 用H2O2处理后的IC50。 XXT 对H2O2 诱导的HUVECs氧化应激的作用

H2O2 处理后的HUVECs细胞存活率显著下降。XXT可抑制存活率下降（图2）。结果表明：和Model组相比，浓度为25~400 μg/ml 的XXT 可促进细胞增殖，阻止H2O2 诱导的HUVECs细胞存活率的下降，但过高浓度的XXT可导致细胞损伤。 XXT对ROS的作用

ROS的形成和氧化应激有关。与NC 组相比，H2O2处理后的HUVECs中ROS 水平升高至118.26%（图3）。XXT 预处理后，ROS水平显著降低，表明：XXT 在H2O2 诱导的HUVECs氧化应激中扮演重要角色。 XXT诱导氧化应激相关基因的差异性表达

本试验用人源氧化应激PCR Array检测Model组和100 μg/ml XXT 处理组的细胞中84种氧化应激相关基因的表达。加XXT后，20种基因上调（倍数变化≥2），18种基因下调（倍数变化<0.5）。其中，8种基因显著上调，9种基因显著下调。 XXT对HUVECs Nrf2基因及其下游激活基因mRNA表达的作用

为了研究XXT对Nrf2及其下游活化靶基因的转录调控是否有影响，本试验采用qPCR。当与模型组相比，50、100、200 μM 的XXT可分别诱导Keap1 活性升高