PCR和RT-PCR技术

多糖同RNA共使用氯化锂沉淀RNA以除去多糖。 沉淀 用于合成cDNA确定退火温度适合您的引物。对于随机六聚体，建议在反应温度保温第一链合成的之前先在25℃保温10分钟。 引物没有很好对于基因特异性引物（GSP），可以试一下其他GSP，或换用oligo(dT)退火 够 或随机六聚体确定GSP是反义序列。 对于＜50ng的RNA样品，可以在第一链cDNA合成中使用0.1μg到0.5μg乙酰BSA。 RNA模板二级将RNA和引物在不含盐及缓冲液条件下变性/退火 结构太多 提高逆转录反应温度，对SuperScriptⅡ可以到50℃，对ThermoScript可以到65℃。 注意：不要在＞60℃时使用oligo(dT)引物，选择一个在反应温度可以退火的GSP。 对于＞1kb的RT-PCR产物，保持反应温度≤65℃。 注意：不要在高于37℃时使用M-MLV。 如果不需要全长cDNA，在第一链反应中使用随机引物。 引物或模板对在PCR前用RNaseH处理。 残余的RNA模板敏感 靶序列在分析尝试其他靶序列或组织 的组织中不表达 PCR没有起作对两步法RT-PCR，不要在PCR步骤中使用超过1/5的逆转录反应产用 在琼脂糖凝较差 物 设计Tm类似的引物。 PCR灵敏度：PCR引物设计避免在引物3'端含有互补序列。避免可以形成内部发卡结构的序列。胶分析中看DNA含有抑制诸如DMSO，SDS和甲酰胺之类的试剂会抑制Taq DNA聚合酶。如果怀到少量或没剂 疑污染了抑制剂，可以使用乙醇沉淀DNA 有RT-PCR产富含GC的模对于GC含量＞50％的模板，使用PCRx Enhancer Solution。 物 板 模板浓度太低 使用10^4拷贝的靶序列，以在25到30个循环中获得信号。 镁离子浓度太从1mM到3mM，间隔0.5mM进行一系列反应，确定对于每个模板和引低 物对的最佳镁离子浓度。注意：对实时定量PCR，使用3mM到5mM的镁离子浓度。 退火温度太高 使用表4的公式估算Tm，把退火温度设定为低于Tm 5℃。因为这些公式只是估算Tm值，所有真正的退火温度实际会高些或低些。 PCR灵敏度：引物浓度太低 最佳引物浓度介于0.1μM到0.5μM之间。为了精确确定引物浓度，在琼脂糖凝胶分析中看到少量或没有RT-PCR产物

起始RNA量不增加RNA量。 在260nm测量光密度，然后使用光吸收值和消光系数计算浓度。（见公式1，2）

RT-PCR特异引物和模板非在第一链合成中使用GSP，而不是随机引物或oligo(dT)。试用允许性：在琼脂糖特异性退火 高温cDNA合成的GSP。 凝胶分析中GSP设计较差 遵循用于扩增引物设计的同样原则 观察到非预RNA中沾染了使用扩增级DNaseⅠ处理RNA。使用没有逆转录的对照反应检测DNA期条带 基因组DNA 体 引物和模板非以2℃到5℃间隔增加退火温度，减少退火时间。 特异性退火 在开始几个循环使用较高的退火温度，然后使用较低的退火温度。 使用Platinum Taq DNA进行自动热启动PCR。 避免在引物3'端含有2到3个dG或dC。 镁离子浓度太对于每一个模板和引物组合优化镁离子浓度。 高 因为扩增复杂使用巢式PCR或递减PCR。 模板导致引物错误起始 沾染外源DNA 使用抗气雾剂的吸头和UDG（见第八章）。 因为二级结构对于GC含量＞50％的模板，使用（1×-3×）PCRx Enhancer Solution。 导致引物结合位点无法接近 PCR忠实性：聚合酶忠实性使用带有校正活性的热稳定聚合酶，如Platinum Pfx DNA聚合酶。 PCR在产物序低 列中引入了循环数太多 降低循环数。 错误 四种dNTP的制备新的dNTP混合物，保证四种核苷浓度相同。使用预混合物。 浓度不同 定量RT-PCR 无cDNA合成 无扩增产量 cDNA合成温度降低保温温度 相对荧光信太高 号小于等于反转录cDNA提高保温温度。重新设计引物 背景或没有产物被二级结模板对照 构封闭 RNA被损害或必要的话更换RNA 降解 RNAse污染 能 灵敏度低 维持无菌条件；加入RNase抑制剂 用DNase处理TaqMan探针，校验荧光是否增强。 必要的话设计和合成探针。 初始模板RNA增加模板RNA的浓度；使用10ng-1μg的总RNA 须在比预期不充分 更高的循环RNA被损害和必要的话更换RNA 中检出产物 降解 RNAse污染 维持无菌条件；加入RNase抑制剂 荧光探针无功确保探针设计的有效性和fluorophore和quencher的存在。 污染。 形成引物二聚设计在3'端没有互补序列的引物。

无效的cDNA 通过增加70％乙醇清洗的次数来去除制备RNA过程中的抑制剂 无效的PCR扩注意：反转录的抑制剂包括SDS、EDTA、胍盐、甲酰胺、磷酸钠和亚增 精胺 调整cDNA合成温度或引物设计 信号高于预反应中加的样降低模板的浓度 期 品太多 在低于预期模板或PCR残隔离污染来源，更换试剂 的循环中即余污染 使用专用的精致移液器。在无DNA区域准备反应，使用抗气溶胶的吸可检出产物 头。 电泳后出现RNA被基因组, 用DNase I预处理RNA 意外的条带 DNA污染 用于第一链合使用基因特异性引物 成的寡聚dT或随机引物 PCR的低特异优化PCR条件 性