植物基因工程第五章

第5章抗非生物胁迫基因及应用

植物一生完全生活在绝对顺利适宜的环境中的情况是罕见的，有些植物整个生活周期都是在极严酤的环境中完成的。胁迫（stress)系指对植物生存和生长不利的各种环境因素的总和。胁迫分为生物胁迫和非生物胁迫两大类。生物胁迫是指病害、虫害和杂草。而非生物胁迫则指不利的理化因子，其详细分类见图5-1

本节分为两大部分，第一部分介绍耐除草剂（herbicide)基因及应用，笫二部分介绍抗其他非生物胁迫基因及其应用。

5.1耐除草剂基因及其应用

通过化学方法来控制杂草已成为现代化农业不可缺少的一部分。除草剂的年产量和年销售设已跃居农药之首，据估计美国每年用在除草剂上的费用大约是50亿美元。除 草剂的应用情况取决于作物对除草剂的敏感性、杂草的性质和施用除草剂的花销。那些 对威胁农业生产的重要杂草具有活性的除草剂，在除去这些杂草的同时能显著地伤害作 物，这就限制了这些除草剂的应用。

以往解决除草剂对作物伤害的途径有以下两条：一是应用对作物伤害小的除草剂和 施用方法，如用1，8-萘二甲酸酐（1, 8-napthalic anhydride)处理玉米种子，从而保护幼苗免受土壤中施用的除草剂硫代氨基甲酸盐（thiocarbamate)的毒害；二是通过杂交育种方法，把和栽培作物亲缘关系近的野生植物的对除草剂的抗性引入到栽培品种 中，如已经把对除草剂梅淬布辛（metribuzin）的抗性引入大豆的栽培品种。然而，上述途径尚未被广泛应用。

随着生物技术的发展，现在已经有能力通过遗传工程的方法来培育耐除草剂的作物 品种。这主要通过两种方法：一是通过植物组织或细胞培养，并结合理化诱变，来产生 对除草剂具有耐性的突变体；二是通过基因工程的方法，把耐除草剂基因导入现有作物 品神。对于前一种方法，有一些成功的报道。但是由于各种除草剂的作用机制不同，所 以利用这种方法来筛选对某一特定除草剂的耐性突变体是有很大难度的。植物耐除草剂 的基因工程已经取得较大成功，耐除草剂的转基因植株的出现，不仅扩大了现有除草剂 的应用范围（特别是那些既对环境安全又行之有效的除草剂>，而且还影响新型除草剂 的设计和使用。

近年来，关于除草剂作用的生化模式和生物中存在的对除草剂的抗性机理的研究，为植物耐除草剂的基因工程莫定了坚实的基础。目前，耐除草剂的基因工程主要有两种策略：①修饰除草剂作用的靶蛋白（herbicide target protein〉，使其对除草剂不敏感，或促其过量表达以使植物吸收除草剂后仍能进行正常代谢；②引入酶或酶系统，在除草剂发生作用前将其降解或解毒。这两种策略都已在成功地应用。

5.1.1几种主要除草剂及其作用机理

5.1.1.1草甘膦

草甘膦（glyphosate)是一种施用于叶片的广潜、非选择性的有机磷类除草剂。它对于许多一年生和多年生杂草都有极强的控制能力。草甘瞵对动物无毐。由于其很容易 被土壤微生物所代谢，所以它在土壤中无活性。草甘膦特异性地抑制植物和细胞中莽草 酸羟基乙烯转移酶（EPSPS)的活性。EPSPS是芳香族氨基酸合成途径中的一个酶，它可逆地催化 S3P ( shikimate-3-phosphate )和PEP ( phosphoenoplpyrurate )缩合成 EPPS。在植物中，大部分EPSPS的活性中心位于叶绿体中。EPSPS是由一个具有转移肽（包含72个氨基酸）的EPSPS前体（preEPSPS)多肽来合成的。转移肽使得前EP-SPS进入叶绿体中。前EPSPS具有催化EPSPS反应的能力，而这种催化活性同样被草甘膦所抑制。

5.1.1.2磺酰脲类除草剂

磺酰脲(sulfonylurea)是一组除草剂，其典型特征是高单位活性。其中绿贫隆 (chlorsulfuron, CS,是glean中的活性成分）和甲脲磺酰甲酯(sulfometuron methyl, SM是oust中的活性成分）是两种最为人知的磺酰脲类除草剂。磺酰脲类除草剂通过抑 制支链氨基酸合成过程中的一个关键酶一乙酰乳酸合成酶(acetolactate synthetase. ALS)来表现其除草剂作用。在植物和微生物中，ALS催化支链氨基酸生物合成中共同的第一步反应，即丙酮酸和丁酮酸与活性乙醛基缩合（缩合产物分别为α-乙酰乳酸和α-乙酰-α-羟丁酸，这两种分子经过脱水和转氨作用形成缬氨酸和亮氨酸)。离体研究表 明植物中的ALS对于CS的抑制作用相当敏感（I50=18-36nmol/L)。磺酰脲类除草剂显著地抑制植物

细胞的分裂，它们对于植物和微生物的毒性可能部分地与酮酸的积累有 关。

5.1.1.3草丁膦

草丁膦（phosphinothricin)是有机磷类除草剂，是非选择性广谱除草剂Basta的活性成分。虽然Basta包含有草丁膦的两种同分异构体，但是D-草丁膦并不具有除草剂活性。L-草丁膦强烈地抑制谷胱甘肽合成酶（glutamine synthetase, GS)的活性。GS在生物界中广泛存在，目前已从细苗、真菌、植物和动物分离获得。植物和细菌的GS在物理性质和调节作用上存在着相当大的差异。在植物体里，GS具有非常重要的角色，它可以解除在氨基酸降解等过程中产生的氨的毒性。植物的不同组织器官中存在着多种GS的同工酶。另外，在叶子中有两种GS的同工酶，一种位于胞质中，而另一种则存在于叶绿体中。但是，不同的GS的同工酶对于L-草丁膦具有同样的敏感性。L-草丁 膦的除草剂活性可能主要来自于氨在植物中的累积。、

5.1.1.4阿特拉津

阿特拉津（atrazine)是三嗪除草剂（triazine herbicide）的主要代表，其主要作用是抑制植物叶绿体中的光合作用。由叶绿体基因psbA编码的32kDa蛋白是叶绿体的主要产物之一，是一种疏水性蛋白，它与叶绿体类囊体膜紧密结合，构成光合作用中心。32kDa蛋白与光系统Ⅱ(PSⅡ)反应中心还原端的笫二个电子受体有关，是质体醌的结合部位，也被称作Qb蛋白。阿特拉津在敏感植物中抑制光合作用的机理是它与醌竞争32kDa蛋白的同一结合位点。阿特拉津与32kDa蛋白结合后，就抑制了PSⅡ电子传递中质体醌传递电子，从而使能量传递过程中断，光合作用停止，最终导致植物死亡。

5.1.1.5溴苯腈

溴苯腈（bromoxyril）是除草剂buctril的活性成分，它对于生长素2,4-D不能控制的杂草特别有效。溴苯腈的作用机理也是抑制植物光合作用中的电子传递。

5.1.2靶蛋白抗性基因及其应用

5.1.2.1抗EPSPS抑制剂基因及其应用

对于植物抗草甘膦的基因工程，在开始时人们考虑出两种方法：一是EPSPS的过量产生，二是应用编码点突变的靶蛋白的基因。

含有aroA基因（编码EPSPS)的E.coli细胞对于草甘膦具有抗性。这些细胞产生了大约17倍的EPSPS,并对草甘膦的抗性提高了8倍。这是第一个关于过量产生EPSPS能够对草甘膦产生抗性的证据。把该基因的多拷贝整合到质粒上，然后把重组质粒导入原寄主菌后发现，这些菌产生了大约100倍的EPSPS,并且酶的Km和其他性质没有改变。该扩增的细菌基因被用来钓出过量产生EPSPS的植物组织中的互补基因。由CaMV 35S启动子控制下的矮牵牛的EPSPS及转移肽基因被导入矮牵牛的细胞中，获得的转化愈伤组织中的EPSPS的量增加了 20?40倍，这些愈伤组织耐受0.5?1.0 mmol/L的草甘膦。由转化愈伤组织再生的转基因植株的田间试验表明，喷洒3.6g/m2 的除草剂Roundup (Monsanto公司销售的草甘膦的商品名），对照植株在14d后全部被杀死，而过量产生EPSPS的转基因植株却能生长到成熟。

不同来源的EPSPS对草甘膦的敏感性变化相当大，例如从肺炎克氏杆菌(Kleb- siella pneumoniae)中分离出的EPSPS的突变体对草甘膦的亲合性降低了16倍。Comai等（1985)从鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium )中分离出一些耐草甘膦的EPSPS的突变体，其中一个突变体是在多肽序列上101位点上发生点突变（原来的脯氨酸被丝氨酸所取代)。编码此突变体的基因被克隆到E. coli，结果使有突变aroA基因的E. coli菌株在2000ug/ml的浓度下能正常生长，而对照菌株生长被完全抑制。 Comaì等把在章鱼碱合酶（octopine synthase)或甘露碱合酶（mannopine synthase)启动子调控下的突变aroA基因导入烟草细胞并获得转基因植株。田间试验表明，喷 Roundup (0.5 kg/hm2) 20d后，缺乏突变酶的对照植株的重量仅是未喷药植株的10%,而两个携有突变aroA基因的转化株系的重量分别为未喷药植株的30%和70%。同时顶端芽的分化也表明转化植株对Roundup并没有显示出完全的抗性。后来，Fillatti 等获得了表达此突变酶的转基因番茄，在0.84 kg/hm2的用药量下，转基因植株表现出了显著的抗性。需要指出的是：在Comai和FiUatti等的研究中，突变aroA基因都没有和编码叶绿体转移肽的基因相融合，因此编码的酶是位于细胞质中。这种外源基因的非专一性地高水平表达是没有必要的，而且还可能造成有毒物质的积累。

Monsanto公司的Kishore等(1995)从生长在添加草甘膦的培养基上的E. coli中分离出一个对草甘膦具有相当强耐性的EPSPS的突变体—SM-1,其对草甘膦的耐性提高了 8000倍，其产生草甘膦耐性的原因也是一个氨基酸序列发生了改变。为了检验叶绿体转移肽的作用，在CaMV 35S启动子的调控下的融合或未融合矮牵牛中转移肽基因的编码SM-1的aroA基因被导入烟草。在获得的烟草转化愈伤组织中，只表达SM -1的愈伤组织被0.5 mmol/L的草甘膦杀死，而同时表达SM -1和矮牵牛转移肽的愈伤组织却不受影响。同时获得的转基因烟草植株的田间试验也表明，在Roundup的用量为1.8 g/m2时,只表达SM-1的转基因植株能够存活，但是其顶端分生组织出现失绿现象。相比之下，同时表达转移肽和SM-1的转基因植侏在此药剂浓度下却未受任何伤害。显然，突变体酶被转移肽运进叶绿体使植株获得了更强的草甘膦耐性。

矮牵牛中的编码突变EPSPS的基因也被克隆，并且被转入多种植物而且赋予它们 草甘膦抗性6其中，烟草的转基因植株在喷洒Roundup 3.6 g/m3的情况下没有受伤害， 并且同未喷药植株一样能够正常开花结籽。Calgene公玥将草甘瞵的耐性基因命名为 “Glyghotol”，于1985年申请了专利。

5.1.2.2抗ALS抑制剂基因及其应用

ALS的靶位点突变体在自然界中普遍存在，人们已在细菌、酵母、植物细胞培养物及种植于田间的作物中发现了这种突变酶。在ALS基因上，有许多位点可以产生突变并赋予抗性。其中，E. coli的ALSⅡ (E. coli有三种ALS的同工酶：ALSI、ALS Ⅱ、ALSⅢ)的抗SM突变体是其在亚基第26位的丙氨酸被缬氨酸取代。此突变酶对SM的抗性比野生型酶提高4倍，并且与野生型同样对缬氨酸的抑制作用具有抗性。酵母的ALS突变体是其第192位的脯氨酸被丝氨酸取代，其对SM的抗性提高了25倍，而对缬氨酸的敏感性下降。虽然E. coli的ALSⅡ在第192氨基酸位点也是丝氨酸，但它对SM仍然敏感，显然，ALS对于SM的抗性不仅仅来自一个特定氨基酸被取代，而且还有蛋白质中其他补偿突变（compensating mutations)。

以酵母ALS基因作为杂交探针，Mazur等人（1987)从拟南芥(Arabidopsis)的对除草剂敏感的株系和烟草的抗除草剂的株系中分离它们的ALS基因。这些基因编码73kDa的ALS前体。离体研究表明，ALS前体在叶绿体中（支链氨基酸生物合成的场所）被加工成为70kDa的多肽，即成熟ALS。拟南芥和烟草的成熟ALS蛋白的同源性为84%,并且它们和酵母细胞的ALS具有明显的同源性。 以对CS敏感的ALS基因为探计，Smith等人从抗CS的烟草植株中分离获得了突 变的ALS基因（hra和c3）并通过介导转化，获得了携带此抗性基因的烟草转基因植株。田间试验表明，表达hra基因的烟草转基因植株对于除草剂的耐性至少提高了4倍。而将烟草的抗除草剂基因导入番茄，获得的转化植株可以抗田间用量的CS。另外，将拟南芥的抗除草剂基因导入烟草后，转基因植株对CS的敏感性下降了约1000倍。

5.1.2.3抗光系统Ⅱ除草剂基因及其应用

自然界中存在着一些对三嗪类除草剂具有耐性的植物，产生耐性的主要原因是ps- bA基因发生了靶位点突变。psbA基因至少有5个氨基酸位点可以发生变化，其中2/3 以上的突变是编码264位丝氨酸的密码被编码甘氨酸或丙氨酸的密码子所取代。

美国哈佛大学的Cheuny等把抗阿特拉津的苋菜psbA基因与编码RUBPCase小亚基的转运肽的序列相融合，并导入烟草细胞。结果表明该嵌合基因整合到了烟草的核基因组上，其产物在正常表达后被转运到叶绿体中，发挥出抗阿特拉津功能。但是获得的转基因烟草植株对阿特拉津的抗性却是有限度的，这可能和突变的32 kDa蛋白的合成率较低有关。

5.1.3除草剂的降解和解毒基因及其应用

现已知道许多不同的酶系统对除草剂有降解的作用，这些酶系统存在于作物、杂草 和微生物中。和靶位点突变抗性相比，降解抗性可能涉及多于一种基因或物质参与。因 此，从细菌中分离对除草剂有降解作用的基因比分离靶位点突变抗性基因要困难得多。 相反地，粑位点突变抗性可能会使作物大幅度减产，而降解抗性产生的这种负效应要小 得多。由降解系统产生的对除草剂的抗性的专一性很强，而且效率很髙。

5.1.3.乙酰CoA转移酶基因及其应用

乙酰CoA转移酶（acetyl CoA transferase)具有使除草剂草丁膦代谢失活的作用，其作用机制在于在乙酰CoA存在的情况下，乙酰CoA转移酶催化乙酰CoA与草丁膦的游离氨基结合，使L-草丁膦转

变为乙酰-L-草丁膦，从而失去除草剂活性。从链霉菌（Streptomyces)分离出的编码乙酰CoA转移酶的基因被称作bar基因。比利时的Plant Genetic Systems (植物遗传部门）的研究人员把bar基因导入烟草、马铃薯和番茄中， 并获得抗Basta的转基因植株，其中转基因烟草植株能够耐受除草剂的量为田间用量的 4?10倍。他们还发现，只要乙酰CoA转移酶在叶中的表达量能达到叶蛋白总量的 0.0001%的水平，转基因植抹就能耐受除草剂的处理。另外，转基因植抹的产量并未受施用除草剂的影响。后来，人们构建人工合成的bar基因，该合成基因保留了天然bar 基因的基本氨基酸序列，但选用了更适宜于植物系统的密码子。利用此基因，科学家获 得了烟草、番茄和苜蓿等植物的转基因植株。

5.1.3.2水解酶基因及其应用

对于利用基因工程来获得除草剂抗性而言，水解酶是一类极好的酶，因为它们在行 使功能时，没有任何能量上的需求。Stalker等（1991)从土壤细菌Klebsiella ozaenae中分离出溴苯腈的降解基因，该基因编码腈水解酶(nitrilase),该酶能够完全地把溴苯 腈转变为无活性产物3, 5-二溴-4-羟基苯甲酸（ 3，5-dibromo-4-hydroxybenzoic acid)。他们把该基因导入烟草后，使烟草获得了高水平的溴苯腈抗性。

虽然溴苯腈和阿持拉津都作用于植物的PSⅡ,但是它们作用的位点不一样。抗阿 特拉津的植物并没有表现出溴苯腈抗性。因此，可以用溴苯腈来控制抗阿特拉津的杂 草。尽管研究人员筛选了很多细胞，但他们还是未能获得抗溴苯腈的叶绿体突变体。这 可能是由于溴苯腈在psbA上的结合位点和叶绿素的结合位点很近，所以任何不能结合 除草剂的的突变体也可能同样不结合叶绿素，从而导致死亡。从这种机理考虑，对溴苯腈的抗性的进化应该是缓慢的，因而把编码腈水解酶的基因导入作物是非常有用的。

5.1.3.1超氧化物歧化酶基因及其应用 许多除草剂[如百草枯（paraquat)]在植物体内产生活性氧并氧化植物细胞质膜，从而导致植物死亡。生物中自然存在清除自由基的酶系统，该系统由多酶组成，超氧化 物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)是这条解毒途径中的第一个酶，故具有清除生物体中自由基的功能。SOD具有多种形式，如Gu/Zn-SOD和Mn-SOD。虽然SOD在生物界广泛存在，但是不同植物及同一植物在不同组织器官和不同时期的SOD含量大不一样。所以，把高效启动子控制下的SOD基因导入植物，可以提高植物的抗逆性。

Tepperman等（1998)首先获得转SOD基因烟草植株，但是表达SOD的转基因植株对百草枯的抗性并没有增强。相反，Perl等把番茄细胞质和叶绿体定位的SOD基因导入马铃薯细胞后，获得的转基因品系对于百草枯的耐性提高，其中含有番茄细胞质Cu/Zn-SOD基因的转基因品系的根培养物耐高达10 umol/L的百草枯。产生这两种不同结果的原因可能是：在烟草的解毒途径中受到其他酶如抗坏血酸过氧化物酶（ascor- bate peroxidase)和谷胱甘肽还原酶（glutathione reductase)的活性水平的限制，而在马铃薯中则不存在这种限制。确实，当用能引起谷胱甘肽还原酶过量表达的基因来转化烟草时，转基因植株和未转化对照植株相比，其对于百草枯的抗性大大增强。

以上介绍了几种主要除草剂及其抗性基因。比较两种策略，我们可看出降解或解毒策略可以作为修饰靶蛋白或靶蛋白过量表达策略的一个有价值的替代方法。解毒酶能够把除草剂的初级和次级副作用都消除掉。当除草剂作用的靶酶具有多种同工酶时，确定关键的同工酶是比较困难的，在此情况下，解毒方法可能是惟一合适的选择。值得注意的是，解毒酶基因还可能赋予植物对多种除草剂的耐性，例如日本神户大学的盐田等从小鼠肝脏克隆了具有药物代谢作用的加单氧酶（monooxygenases)(细胞色素P450的一种）基因，并把该基因与P450的电子供体的还原酶基因结合。把此融合基因导入烟草后，烟草植株获得了对包括生长素2, 4-D在内的多种除草剂的耐性。另外，一些其他的策略对于耐除草剂的基因工程也是可行的，例如抑制植物对除草剂的吸收和转运， 但是由于目前我们对于除草剂的吸收和转运知之甚少，所以这还只是一种设想。 5.2抗其他非生物胁迫的基因及其应用

目前，向植物导入的抗这种逆境胁迫的基因有两类。

第一类基因编码产物是在植物的抗性中直接起保护作用的蛋白质。这些蛋白质可细分为以下五种：①合成渗透调节物质的关键酶类，如脯氨酸合成酶等；②具有解毒作用的酶类，如超氧化物歧化酶（SOD)等；③保护生物大分子及膜结构的蛋白质，如抗冻蛋白及胚胎发生晚期丰富蛋白（LEA)