林业生物技术--ppt

几种重要的工具酶的酶学性质及在基因工程中的应用 酶 1.限制酶（Ⅱ） 来源 活性 底物 dsDNA 辅因子 特点 Mg2＋ 用途 微生物 内切 400RE/350M 特异性识别和1．DNA重组切割dsDNA,产2.组建新质粒生平头或粘性3.构建物理图（5?-3?-）末端 谱4.制备探针5.DNA序列分析6.分子杂交 活力：粘端>平1．DNA重组端 2.DNA序列分析 对dsDNA外切1.制备探针活性可被5?－2.DNA序列分3?pol活性所 析 特点 用途 2. 连接酶（ligase） T4phage 连接两个片段 dsDNA Mg2+ ATP Mg2＋ 3. DNA聚合酶ⅠE.coli （DNA polⅠ） 5?－3?聚合；ssDNA 3?-5?外切；dsDNA 5?-3?外切 dsDNA ssDNA 活性 底物 酶 来源 辅因子 4. 逆转录酶RNA肿瘤病毒 RNA→cDNA； ssRNA Mg2＋ （Reverse DNA→DNA ssDNA Transcription） RNAseH解旋 RNA:DNA cccDNA 5. SI核酸酶（Nase 米曲霉 SI） 切单链 ssDNA ssRNA Zn2＋ RNA指导 DNA指导 解超螺旋 切除单链 制备cDNA 切尾巴，产生平端，用于质粒组建和DNA重组 6. Bal31 乳白短杆菌 外切 dsDNA Ca2＋ 5?3?两端同时 ??㏒???筹速外切 琰茞��?ü Co2＋存在可造成人工粘具有延伸3?－端，便于重组；OH的DNA为32p标记DNA模板 分子3?末端 ??㏒???阻断片段或载体自身环化。 琰茞��?ü 7. 末端转移酶小牛胸腺 （TTE） 加dNTP到dsDNA or Mg2＋ DNA分子3?－ssDNA3?-OH OH末端 切除磷酸 ds,ss Ca2＋ Mg2＋ 8. BIP/CIP 细菌/牛肠 第三章 基因工程载体 主要内容

一、载体的功能及特征 二、质粒（plasmid） 三、噬菌体或病毒DNA

四、考斯质粒（cosmid）与噬菌粒 五、人造染色体载体

一、基因克隆载体概述

要让一个从A生物细胞内取出来的基因在B生物体内进行表达，首先得将这个基因送到B生物的细胞内去。能将外源基因送入细胞的工具就是运载体。 基因克隆载体(DNA克隆载体)：通过不同途径能将承载的外源DNA片段(基因)带入受体细胞，并在其中得以维持的DNA分子。 （一）载体的发展概况

（1）第一阶段（1977年前）：天然质粒和重组质粒的利用，如pSC101, colE1, pBR313和pBR322 (1977, Bolivar et ）

（2） 第二阶段：增大载体容量（降低载体长度），建立多克隆位点区和新的遗传标记基因。如pUC系列载体。

（3）第三阶段：进一步完善载体功能以满足基因工程克隆中的不同要求，如M13mp系列载体，含T3，T7，sp6启动子载体，表达型载体及各种探针型载体。 （二）载体的功能

（1）运送外源基因高效转入受体细胞

（2）在宿主细胞或受体细胞中自我复制或随整合的受体细胞染色体DNA一起复制．

（3）为外源基因的扩增或表达提供必要的条件

（4）克隆载体进入细胞后有可供选择标记． （三）载体应具备的条件

（1）在克隆载体DNA分子合适的位置有一至多个克隆位点，供外源DNA片段组入克隆载体DNA分子。

（2）至少有一个复制起点，因而至少可在一种生物体中自主复制。

（3）至少应有一个遗传标记基因，以指示载体或重组DNA分子是否进入宿主细胞。 二、质粒克隆载体

（一） 质粒的一般生物学特性

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比病毒还简单的亚细胞结构，一旦离开寄主细胞则无法繁殖。

独立于染色体之外进行复制和遗传,又依赖于宿主编码的酶和蛋白质来进行复制和转录。

发现：细菌，偶见于链霉菌和酵母

（1）质粒是细菌染色体外能够自主复制的环形双链的DNA分子。

（2）在宿主细胞内，质粒一般以超螺旋共价闭合环DNA分子（ccc-DNA）的形式存在。 （3）在体外理化因子作用下，质粒可以成为开环DNA分子（oc-DNA）或线形DNA分子（l-DNA）。

（4）在变性条件下，质粒可成为单链DNA分子（ss-DNA）。 （5）质粒DNA分子大小1-100Kb以上。

（二）质粒DNA的复制

1、质粒能利用寄主细胞的DNA复制系统进行自主复制 2、复制方向性：纯单向性（ColEI）；纯双向性（F质粒）；既有单向又有双向性（R6K）。 3、根据在每个细胞中的分子数（拷贝数）多寡，质粒可分为两大复制类型：

? 严紧型复制控制的质粒 （stringent plasmid）

1 – 数个 拷贝

? 松弛型复制控制的质粒 （relaxed plasmid）

10 个 拷贝以上

4、拷贝数的控制机制 – 质粒DNA复制启动控制

? 控制复制引物与模板的结合

? 控制复制起始因子与复制起始位点（ori）的结合 （三）质粒的不亲和性

亦称为不相容性，是指在没有选择压力的情况下，两种亲缘关系密切的不同质粒，不能够在同一个寄主细胞系中稳定地共存的现象。在细胞的增殖构成中，其中必然有一种会被逐渐地排斥（稀释）掉。这样的两种质粒称为不亲和质粒。

以大肠杆菌的质粒为例：

ColE1、pMB1 拥有相似的复制子结构，彼此不相容 pSC101、F、RP4 拥有相似的复制子结构，彼此不相容 p15A及其衍生质粒拥有相似的复制子结构，彼此不相容 （四）质粒迁移

革兰氏阴性菌的质粒可分成两大类：

1、接合型质粒 能在天然条件下自发地从一个细胞转移到另一个细胞（接合作用），如F、Col、R质粒等

2、非接合型质粒 不能在天然条件下独立地发生接合作用如Col、R的其它成员 注意

某些非接合型质粒（ColE1）在接合型质粒的存在和协助下，也能发生DNA转移，这个过程由 bom 和mob 基因决定 （五）携带特殊的遗传标记

野生型的质粒DNA上往往携带一个或多个遗传标记基因，这使得寄主生物产生正常生长非必需的附加性状，包括：

1、物质抗性 抗生素、重金属离子、毒性阴离子、有机物 2、物质合成 抗生素、细菌毒素、有机碱

这些标记基因对DNA重组分子的筛选具有重要意义 （六）质粒载体

质粒DNA的分离纯化

实验室一般使用下列三种方法制备质粒DNA： （1）氯化铯密度梯度离心法

质粒DNA纯度高、周期长、设备要求高、溴乙锭污染 （2）沸水浴法

质粒DNA纯度底、快速、操作简便 （3）碱溶法

质粒DNA纯度、操作周期介于氯化铯法和碱溶法之间 （七）构建质粒克隆载体的基本策略

1、能在转化的受体细胞中进行有效的复制，并有较多的拷贝。 2、含有尽可能多的克隆位点。 3、含有供选择克隆子的标记基因。

4、构建的质粒克隆载体DNA分子尽可能小。

5、根据特殊需要，使构建的质粒克隆载体中组装各种“元件”（小DNA片断），构建成不同用途的质粒克隆载体。

质粒克隆载体的设计和构建过程的原则：

1、选择合适的出发质粒（亲本质粒）。 2、正确获得构建质粒克隆载体的元件。 3、组装合适的选择标记基因。 4、选用合适的启动子。