流式细胞仪SOP - 图文

1）用FACSComp和CaliBRITE beads检测仪器的工作性能，调节仪器的基本设置。在成功的基础之上（至少两色Lyse/Wash），方可进行HLA-B27的调试； 2）充分混合HLA-B27 calibRation beads，垂直向下滴两滴到1ml FACSFlow或PBS中，混匀，待测；

3）进入FACSComp软件，在Set Up窗口选择HLA-B27 Calib，输入正确的Beads Lot Number，Suffix和HLA-B27 Lot Number，Suffix，点击Accept，进入调试窗口；

注意：Beads Suffix和 HLA-B27 Suffix中分别隐藏了FL1 PMT的标准和decision marker的位置，对于结果至关重要，不可弄错。 4）上样，点击Start，软件开始自动调节FSC放大器的倍数和FL1 PMT的电压`，获取结束后，调试后的结果会被自动保存，并生成Summary Report，报告中包含所有你输入的信息，仪器当前的设置，调试的结果，FSC及FL1的直方图等。

5）调试成功后，也就意味着此时的仪器已经准备好做HLA-B27的检测了，当您进到Patients窗口时，调试后的仪器条件会自动下载，不要更改任何条件，否则将影响您最终的结果。

? 运行条件

硬件要求：BD公司的FACSCalibur，FACSort，或FACScan流式细胞仪，使用FACStation数据处理系统。

软件要求

? HLA-B27软件

? Macintosh操作系统7.1以上 ? FACSComp

? HLA-B27软件文件

Flow Cytometry Standard（FCS）Data file

HLA-B27可生成并阅读FCS2.0数据文件，一个文件包括一个样本的所有数据。该文件无法浏览，但可进行分析，生成实验室报告。 ? Schedule Document File

这个文件包括所有输入的信息和参量，文件名后缀为.sch，如你选择保存这个文件（软件不会自动保存），你可打开查看，或继续未完成的操作，或者增加更多的样本。每次只能打开一个文件，不能打印。

? Laboratory Report File

这是一个PICT文件，包括单个样本的分析结果以及FL1的直方图和FSC-SSC，FSC-FL2的点图，按管序排列，后缀名为.lab。可打开，打印，但不可编辑。

? Summary Report File

TEXT文件，包含所有样本的分析结果。一个Schedule document文件对应一个Summary report，文件名后缀为.sum，可打开，输出，打印。

? 菜单介绍 Apple菜单

包括About HLA-B27，HLA-B27 alias及其它应用程序命令。从About HLA-B27中可得知HLA-B27这个软件的版本和系列号。 File菜单

? New Schedule 每次打开HLA-B27软件是都会生成一个新的schedule document，若当前状态下没有schedule document，你可通过这个命令打开一个新的。

? Open Schedule 打开一个已经存在的并已被保存的schedule document。 ? Open Lab Report 打开一个已经存在的并已被保存的Lab Report。 ? Close 关闭当前的的schedule document 或Lab Report。 ? Save 保存schedule document。 ? Save As 将当前的schedule document换一个名字保存或保存到另外的文件夹中。

? Save Report 保存Lab Report或Summary Report。 ? Page Setup 选择打印模式。 ? Print 打印报告。 ? Quit 退出程序。 Edit菜单

? Undo 删除当前的文本编辑命令，回到原来的状态。

? Cut 从document中剪切所选的文本内容，并将其保存在剪贴板上。 ? Copy 复制所选的文本内容，并将其保存在剪贴板上。

? Paste 将剪贴板中被剪切或复制的文本内容粘帖在光标所在的位置。 ? Clear 删除所选的文本内容。

? Select All 选择所有的文本内容。 ? Show Clipboard 显示剪贴板上的内容。 Cytometer菜单

? Detector/Amps 调节PMT的电压以及放大器的倍数。 ? Threshold 调节阈值。

? Compensation 调节补偿，减少荧光信号之间的的重叠。 ? Status 显示仪器的当前状态。

? Instrument Setting 查看、打印当前的仪器设置，保存当前的设置，或打开并下载原有的设置。 HLA-B27菜单

? Sign in 输入操作者，单位及实验室主任，登录软件。 ? Set up 输入本次测试的有关资料。

? Calibration 运行FACSComp及HLA-B27调试。 ? Patiens 输入病人资料。

? Preference 设定输出，打印及比例尺等参数。

? 软件运行 4） Signing In

输入操作者，单位及实验室主任，其中操作者是必须的。 5） Setting Up

?

选择数据来源（Data sources）

From Data Files：对以前保存的数据作分析

From Cytometer：运行样本，获取数据，并自动进行分析。如你选择这种模式，请输入须获取的细胞数（15000-50000），默认值为15000。在这里还显示了HLA-B27试剂及调试微球的产品批号，但不能编辑。 ? 确定您希望自动保存的文件类型及保存位置

若您是获取数据进行分析，建议您最好保存数据文件以备日后再作分析。所有文件的都有默认的保存路径且可通过Location更改。 ? 确定文件名的前缀

可以是病人姓名，病人编号，病历号，日期或用户自定义。 ? 选择阅读报告所需的时间

建议您选择Until “Next”Button Pressed 6） Calibration

若您选择的数据来源是From Cytometer，Setting Up之后会出现Calibration窗口，显示您最近一次的调试结果及时间，您可从这里进入FACSComp做HLA-B27的调试。若您在运行软件之前已经做完了调试工作，您可在这里点击Skip FACSComp，进入下一个窗口。

7） 输入病人资料 ? 获取分析模式

在相应栏中填写病人姓名，病人编号，或病历号，点击Run Test进入获取窗口。 ? 分析模式

点击Add Patient Files，选择需要分析的数据文件，填加到病人信息栏中，点击Run Test进入分析。

8） 获取

? 上样，将流速调到HI，不要调节仪器的设置，此时仪器的条件是经过调试适

合于HLA-B27测试的，任何变动都将影响最后的结果。 ? 点击Acquire，开始获取细胞，直到获取到所需的细胞数。

在获取的过程中，如需要可以点击Pause键暂停，暂停后您有如下选择： Stop 结束所有的测试回到Patiens窗口

Restart 清除刚才保存的不完整数据，回到获取前状态，再点击Acquire重新开始获取

Skip 放弃当前的样本测试，进入到下一个样本的获取 Resume 继续刚才没有完成的获取

Analyze 计算现有获取的数据生成报告，但至少要获取15000个细胞，Analyze键才被激活 9） 分析

获取结束后，软件自动开始分析，分析的过程非常短暂，然后生成实验室报告。实验室报告包括每一位病人的下列资料：

? ? ?

FCS文件名以及在Sign In，Set Up，和Patients中输入的全部信息 获取样本的日期和时间 门内的细胞数，预先设定的FL1定标值，样本FL1的平均值和结论（HLA-B27阳性或HLA-B27阴性或是其它错误信息）

? FSC-SSC点图，FSC-FL2点图显示门的设定和FL1的直方图显示预设的靶值

以及样本FL1的平均值

注意：若样本FL1的平均值与定标值一样，同样判定为HLA-B27阳性 ? 可能出现的错误信息

点击Next键继续下一个样本的获取，直到所有的样本都分析完后，软件生成一份总结报告，包括所有样本的下列资料：

? FCS文件名以及在Sign In，Set Up，和Patients中输入的全部信息 ? 预先设定的FL1定标值，样本FL1的平均值和结论（HLA-B27阳性或HLA-B27

阴性或是其它错误信息） ? 可能出现的错误信息

若还要检测更多的样本，点击More Tests，在出现的Patients窗口填入病人的有关资料。 10） 退出

点击File菜单下的Quit键，退出程序，若您还没有保存Schedule document文件，软件在退出时会询问是否需要保存。

? 质量控制

为了得到可靠的结果，BD要求在检测之前一定要用FACSComp，CaliBRITE beads，HLA-B27 calibration beads成功调试仪器。

BD建议您在每一次测试样本前，同批处理一个已知HLA-B27阳性和HLA-B27阴性的样本，作为测试系统的质控品。

HLA-B27软件采用如下标准来评价结果的可靠性：

1） 获取的细胞中至少有2%为T淋巴细胞以保证软件能够设门； 2） CD3+和CD3-细胞群要能清楚分开，软件能够识别。

? 常见错误排除

问题 可能原因 解决方法 找不到合适的门 在所有获取的细胞中，淋巴细胞 占了不到2%，可能因为：

1．仪器设置不对； 1.检查所有的仪器设置

是否与调试报告一致；

2．红细胞裂解不完全； 2.确定所有的处理步骤是

否与说明书建议的一致；

3．用错试剂； 3.检查所用试剂是否正

确，并重新制备样本；

4．仪器故障 4.重新调试仪器 CD3+阳性群与CD3-阴性群细胞无 法明确区分，可能原因：