流式细胞仪SOP - 图文

八、HLA-B27分析

8．1 检测HLA-B27的意义

HLA抗原是人类主要组织相容性复合体（Major Histocompatibity Complex， MHC）的表达产物，在免疫系统中主要负责细胞之间的相互识别和诱导免疫反应，调节免疫应答的功能。根据HLA抗原结构，功能与组织分布的不同，可分为三类：Ⅰ类分子为HLA-A、-B、-C系列抗原，广泛分布于各组织有核细胞表面，包括血小板和网织红细胞，成熟的红细胞一般不含HLA抗原；Ⅱ类分子为HLA-D/DR、-DP、-DQ系列抗原，主要在B细胞和抗原提呈细胞上表达，这两类抗原都与移植有关，其中Ⅱ类抗原更为重要；Ⅲ类分子为补体成分。

近年来研究HLA与疾病相关性的资料表明，某些疾病的发生率与一些特殊型别的HLA检出率有关，这些病大多是发病机理不明并伴有免疫功能异常和有遗传倾向性的疾病，因此，分析HLA抗原表达情况不仅有助于了解发病机理，对于疾病的诊断、预防和预后判断都有重要意义。

HLA-B27基因属于Ⅰ型MHC基因，基本上表达在机体中所有含核的细胞上，尤其是淋巴细胞的表面有丰富的含量。早在二十多年前，人们就已发现HLA-B27抗原的表达与强直性脊椎炎有着高度相关性，超过90%的强直性脊椎炎患者其HLA-B27抗原表达为阳性，普通人群中仅5-10%的为阳性，而强直性脊椎炎由于其症状与许多疾病相似而难以确诊，因此HLA-B27的检测在病情的诊断中有着重要意义。在脊椎性关节病这一类的疾病中除了强直性脊椎炎以外，还有许多其它的疾病与HLA-B27抗原的表达有着或多或少的相关性，比如说Reiter，s综和症，HLA-B27阳性率为70-90%；银屑病性关节炎，HLA-B27阳性率为50-60%；葡萄膜炎（眼色素层炎），HLA-B27阳性率为40-50%；溃疡性结肠炎伴有关节病，HLA-B27阳性率为5-10%等等，因此HLA-B27的检测在这些疾病的诊断中是一个非常有价值的指标。

8．2 HLA-B27的检测方法 8．2．1 传统方法

常规检测HLA抗原的方法为Terasaki和McClelland提出的微量细胞毒实验，其基本原理是：标准抗血清中含有细胞毒抗体，与待测细胞表面相应的HLA抗原结合，激活随后加入的补体，使细胞损伤或裂解，再利用染料排斥实验，通过显微镜判断受检细胞的活性。抗血清由经产妇提供，为多克隆的，因此其灵敏度和特异性都很难达到100%；再加上需要密度梯度离心来分离淋巴细胞，整个实验过程相当耗时且劳动强度较大；除此之外，它还需要专门的技术人员来诠释实验结果，无法普及。 8．2．2 流式细胞术

单克隆抗体和荧光素的开发使得流式细胞仪在各个领域得到空前的发展，多参数同时测定使得流式细胞术得以快速，灵敏，特异地检测某一特定细胞群中某一特异性抗原的表达。与传统方法相比，用流式细胞仪来检测HLA-B27的表达，无须分离淋巴细胞，操作简单，自动化程度高；灵敏度可达100%，特异性达97.4%；结果稳定，样本之间，不同仪器之间，不同实验室之间可重复性高。

BD公司推出的HLA-B27试剂盒与HLA-B27自动软件配套使用，为我们提供了一种快速准确地检测病人T-淋巴细胞表面HLA-B27抗原表达的方法。 ? 试剂盒介绍

Reagent A：Anti-HLA-B27 FITC/CD3 PE，1.5ml 包括FITC标记的抗-HLA-B27（GS145.2），与HLA-B27抗原特异结合，PE标记的抗-CD3（SK7），与人类T淋巴细胞特异结合。 Reagent B：10X Lysing Solution，30ml 使用前，用蒸馏水稀释10倍。

Reagent C：Calibtation beads for FL1，1.5ml 用于调试仪器。 ? 实验原理

将单克隆抗体与外周血共孵育，裂解红细胞，洗涤固定后，上机检测。在检测之前，仪器已经CaliBRITE beads和HLA-B27 calibration beads调试成功，并通过试剂批号的后缀确定了decision marker的位置。

HLA-B27软件首先在FSC-FL2的点图上确定CD3强阳性细胞群体的位置，设定一个CD3+T淋巴细胞门，然后再根据FSC设定光散射门，去除FSC过大或过小的细胞，确保门内至少有50%的CD3+T淋巴细胞，这样通过二者的结合，将随后进行的分析严格地定位在T淋巴细胞上。

注意：HLA-B27单克隆抗体（GS145.2）不仅可与所有已知的HLA-B27亚型结合，还会与HLA-B7发生交叉反应，少数情况下与其他HAL-B等位基因的产物也能结合。由于T细胞只表达HLAⅠ型抗原，所以通过分析T淋巴细胞上的抗-HAL-B27 FITC平均荧光强度，就能最大限度地减少检测假阳性，将HLA-B7或其他交叉反应阳性而HLA-B27阴性的样本与确实表达HLA-B27的样本区别开。

软件随后计算FSC/FL2门内细胞抗HLA-B27 FITC信号的平均荧光强度，并与decision marker的值相比较，大于或等于则判定为HLA-B27阳性，小于则为HLA-B27阴性。decision marker的值可从试剂批号的后缀中得到。由于每一批试剂的后缀都可能不同，因此，一定要注意输入正确的后缀。

HLA-B27阳性样本 HLA-B27阴性样本

? 操作步骤

样本的收集和准备

用K3EDTA或heparin或ACD抗凝的真空采血管收集至少1ml的外周血，若不能及时染色，则最好选用ACD或Heparin，因此两种抗凝剂对保存细胞表面抗原之抗原性为了保证实验结果的可靠性，持久性较佳。请尽量在采血后24小时

内进行染色，染色前将抗凝血室温放置，无须冷藏。固定保存、冷藏保存的样本和发生溶血的样本都不应该使用。 染色和固定

1) 在试管上对应于每一个样本作好识别标志； 2) 加30ul试剂A到试管中；

3) 用微量移液器小心地将50ul充分混匀的抗凝血加到进样管的底部，确保WBC

的浓度在3.5×103-9.4×103WBC/ul之间，低速混匀3秒钟，室温避光静置15-20分钟；

注意：小心避免血样加到试管壁上，以免血与试剂不能充分接触，静置时避免样本直接光照

4）将10X 溶血素用蒸馏水稀释成1X，每管中加入2ml 室温1X的溶血素，立即低速混匀，避光室温静置10-12分钟，不要超过12分； 注意：溶血时间不应太长，以免破坏白细胞 5）静置后立即离心，室温，5分钟，转速300xg；

6）吸去上清液，留大约50ul液体于试管中以免损伤细胞团；

7）低速混匀，重悬细胞，每管中加入2ml 含0.1%叠氮钠的PBS或CellWASH清洗细胞，低速混匀，室温离心5分钟，转速200xg； 8）吸去上清液，留大约50ul液体于试管中以免损伤细胞团；

9）低速混匀，重悬细胞，每管中加入0.25ml 1%的多聚甲醛来固定细胞，低速混匀，固定30分钟； 10）

将已处理好的样本管盖好，避光保存于2-8℃以待上机检测。最好在染

色后24小时以内分析样本，上样前充分混匀悬液以防细胞聚集。 ? 仪器调试

由于HLA-B27的检测是基于抗HLA-B27平均荧光强度与decision marker的比较，而不同的流式细胞仪由于其光学系统和电子系统的微细差异可能导致测出的荧光值发生变动，为了保证同样的试剂在不同的仪器上得到同样的结果，就需要以相同的标准来调试每一台仪器的FL1的电压，而这是通过试剂盒中的HLA-B27 calibRation beads来实现的。