流式细胞仪SOP - 图文

FL3-%FL2 从FL3探测器中减去PE的信号

FL3-%FL4 从FL3探测器中减去由488nm激光器激发的APC的信号 FL4-%FL3 从FL4探测器中减去由635nm激光器激发的PerCP的信号 * 由于PerCP的信号不会被FL2收集，因此FL2-%FL3是不需要的。 ? 灵敏度的测试

仪器设置的调节完成后，FACSComp将检测仪器的灵敏度。 荧光灵敏度测试

FACSComp获取10000个粒子，分别计算labeled-beads和unlabeled beads在FL1、FL2、FL3上的荧光强度平均值之间的separation，而FL4的灵敏度，则是计算PerCP-和APC-beads在FL4上的荧光强度平均值之间的separation。 侧向散射光灵敏度测试

仪器在FSC参数上产生一个电子测试脉冲，FACSComp获取10000个粒子，计算背景噪音和SSC信号的平均值之间的separation。 前向散射光灵敏度测试

这时仪器的电子测试脉冲关闭，FACSComp通过降低FSC的域值来搜索FSC的噪音；一旦找到噪音水平，FACSComp就以此为阈值获取10000个粒子，并计算域值和FSC信号的平均值之间的separation。

任何一个参数的灵敏度测试的结果只有两个：通过或不通过。而对于每一个特定的参数，其信号与噪音之间，或荧光标记与未标记之间，或PerCP与APC之间的最小的separation value是已经由每个bead lot ID最后一位标记确定的，如果FACSComp计算出来的separation大于或等于这个最小separation，则这个参数的灵敏度测试也就通过了。

? 时间延迟的校准（对于双激光，配有FL4 PMT）

如果您的仪器是配有双激光并带有FL4 PMT， 当unlabeled baeds 管中APC-beads 被机器检测后FACSComp将自动进行时间延迟的调校，这保证了仪器能够同时处理由不同的激光器产生的信号。 ? HLA-B27的校准

在进行HLA-B27抗原检测之前，您必须使用HLA-B27调试微球来调节仪器，包括调节FL1和FSC。而HLA-B27调试能够进行的前提条件是您的软件中必须保存有一次成功的至少是两色的Lyse/Wash Calib File。 ? LeucoCOUNT

LeucoCOUNT是一个计数leucoreduced血制品中残余白细胞个数的方法。4.1版本的FACSComp为您提供了一个在Lyse/No Wash Assay成功的基础之上，自动保存LeucoCOUNT calibration file的选择。

? 优化

由于塑料微球和细胞有着不同的光学性质，通过运行FACSComp所得到的仪器的设置对于生物样本不一定是最合适的，因此，有必要用正常人的样本来调节仪器，使其最佳化。您可以在FACSComp中进行优化，或者在您每一次跑样本前，用CellQuest来做优化。 7.3

FACSComp的运行

7.3.1 CaliBRITE Beads的准备

? 充分混合装有CaliBRITE Beads的小瓶；

? 将瓶口垂直向下挤一滴unlabeled-beads到装有1ml鞘液的试管中，混匀，

在试管壁上标上unlabeled；

* 注意：若是配有双激光做四色，则须在unlabeled管中再加一滴APC-beads ? 在另一个装有3ml鞘液的试管中依次加入unlabeled-、FITC-、PE-、PerCP-、

和APC-beads（若做四色）各一滴，混匀，在管壁上标上mixed； * 注意：PerCP不很稳定，最好在上机前加入 ? 避光放置，准备上机。 7.3.2

软件环境的设置

? 确定计算机和主机之间已连接好，先开主机，再开计算机； ? 从Apple Menu下进入FACSComp；首先出现的是Sign In视窗

? 在SignIn视窗中填入下列信息：操作者、机构、实验室主任，但只有操作

者是必须填入的，计算机将保存这些信息； ? 单击Accept，进入Set Up视窗；

? 在Assay Selection下选择你需要的Assay：Lyse/Wash、Lyse/No Wash或

HLA-B27 Calib；

FACSComp可提供三种不同并可连续进行的Assay：

1.Lyse/Wash 用于溶血素洗涤的样本（两色、三色或四色）； 2.Lyse/No-Wash 用于溶血处理后免洗的样本（三色或四色）；

3.HLA-B27 用于做HLA-B27抗原检测的样本，它必须在Lyse/Wash

检测成功的基础之上并用HLA-B27调试微球才可进行

? 在CaliBRITE Beads Lot Ids中根据每一种beads所对应的编码输入Lot ID； * 若你选择了HLA-B27 Calib，请输入HLA-B27 CaliBRITE Beads Lot ID

Reagent Lot ID；

? 在Automatic Saving Options中，你可以选择自动保存或不保存Summary

Report，若自动保存，软件会根据它的命名原则给予这份Report一个文件名，并保存在特定的位置，你可以通过单击Location来更改文件名以及保存的位置；

? 若你已知你通常所用的阈值（和Gain），你可以在Lyse/Wash Settings或

Lyse/No Wash Settings中输入，但是这些值对FACSComp的运行没有任何意义。它将被保存在Calib File或Calib File.LNW中，当您下载Calib File Settings时一起被下载； ? 设定参量；

FACSComp允许您在优化、输出数据、打印报告、自动进样、保存LeucoCOUNT calibration file、选择LJ数据输出等参量都上进行设定。 从FACSComp菜单中选择Preferences，出现一个标题为Preferences的对话框，在对话框的最左边单击任何一个参量的图标，根据您的需要进行设定： ? Optimization 允许您改变文件名和点图的X、Y轴的参数 ? Export 允许您选择输出数据的形式

? Print 允许您选择是否在每一次Assay结束后打印Summary Report ? LJ Data 允许您选择保存30或60次的Summary Report的结果到输出文

件中，或者不保存

? Loader允许您选择是否用自动进样系统

? LeucoCOUNT 软件会在成功的Lyse/No Wash Assay的基础上，自动保存

LeucoCOUNT calibration file 设定完成后，单击Save键保存所有的设定

? 在Set Up视窗的右下角单击Run，出现PMT视窗，这时你已准备好测试了

7.3.3 Beads的检测

? 将功能键放在RUN的位置，流速设成HI，将混匀的标有unlabeled的试管放

在支撑架上；

? 单击Start，开始调节PMT；

FACSComp先获取5000个beads，在单个beads群的位置设一个gate，然后开始自动调节PMT的电压。对于双激光配有FL4 PMT的仪器，软件会检查unlabeled试管中是否含有APC-beads，如没有，第二根激光器将被关闭，软件只会调节FL1、FL2或FL3的PMT；如有APC-beads，且在Set Up时APC-beads Lot ID也已经输入，则软件将会调节FL4的PMT。

FACSComp根据Target Value调节PMT到预期值，然后在窗口的底部出现一行信息“PMTs Set Successfully”。这时软件会暂停5秒，然后自动进到下一个调节-补偿或是时间延迟的调校（如有APC-beads）。

如遇到下列两个情况中的任何一个，FACSComp将进入到手动调节的模式： 1．流速小于400粒子/每秒 2．PMT自动调节的时间长于75秒

单击Manual键，出现Target Value窗口，根据TargetValue调节Detectors/Amps，使得SSC的PMT在Target Value±5的范围内，而荧光的PMT在Target Value±2的范围内。

? 如软件在unlabeled试管中测到APC-beads，则在PMT调节完后，马上进行

时间延迟的调校；如果调试成功，会出现“Time Delay Calibration was successful”，然后直接进入补偿视窗；如果调试不成功，你有5秒钟的时间决定是再试一次，还是重复开始的PMT调节，或是继续到下一步调节补偿；若你在5秒内还没有决定，软件自动进到补偿的视窗。如果你在时间调校失败的基础上继续补偿的调节，那么你所得到的FL3-%FL4和FL4-%FL3 的值会有较大的变化。

? 将unlabeled试管从支撑架上取下，换上混匀的标有mixed试管； ? 单击Start开始调节补偿；

FACSComp自动调节补偿，直到获得target mean difference（或target mean for FL4）。 注意事项：