流式细胞仪SOP - 图文

七、 FACSComp

7.1 FACSComp简 介

FACSComp是BD公司自动设置仪器的应用软件，它不仅可通过标准微球（CaliBRITE beads）来监测仪器的工作状态，还可以为人类外周血淋巴细胞免疫分群的应用提供常规的、自动化的仪器设置。流式细胞仪包含了一些灵敏的光电元件，为了保证实验结果的一致性，最好每天用CaliBRITE beads来运行FACSComp软件。

7.1.1 FACSComp运行条件 硬件

? BD公司生产的FACSCalibur、FACSort或FACScan系列流式细胞仪，若做四

色，则必须具备配有FL4荧光探测器的FACSCalibur或FACSort； ? FACSComp在Power Macintosh和Quadra 650上都能运行；

? FACSComp可以支持自动进样系统，但要求LoaderManager3.2或更高的版本

存在。 软件

? Power Macintosh AcqLibPPC 3.0.1或更高BDPACDriver1.0.2； BDPACInit 1.0.2或更高； BDPAC 1.0.2； ? Quadra 650 BDMAC 3.0 ? Macintosh系统软件7.5.3，7.6.1或8.1；

? 对于HLA-B27的调试，需HLA-B27软件3.2或更高的版本； ? 对于FACS Loader，需LoaderManager3.2或更高的版本； 试剂

? CaliBRITE Beads

CaliBRITE beads是已知光散射和荧光强度的标准塑料微球，大小在5-6 um 左右。

BD公司生产的beads包括下列5种：

无荧光标记的beads FITC-标记的beads PE-标记的beads

PerCP-标记的beads APC-标记的beads

每一种beads都有一个相应的6位编码（lot ID），例如，12493N。其中最 后一位代码决定了下列值：

1．FSC和SSC的最小separation values（unlabeled bead的后缀） 2．FL1，FL2和FL3的最小separation values（FITC，PE，PerCP- bead的后缀）

3．FL4 PMT的靶值（APC-bead的后缀）

4．FL4的最小separation values（PerCP，APC-bead的后缀） ? 鞘液

用鞘液稀释CaliBRITE beads制成新鲜悬液。 ? HLA-B27试剂盒

如你准备做HLA-B27的调试，需用HLA-B27试剂盒中的calibration beads制备悬液，其中beads lot ID的后缀决定了FL1的靶值而HLA-B27 reagent lot ID的后缀决定了样本分析时marker所在的位置。

7.1.2 FACSComp的文件类型

FACSComp软件可以生成下列类型的文件： ? Summary Report File

无论是对于Lyse/Wash Assay还是Lyse/No Wash Assay，都会生成两个Summary Report File：a text file文本文件和a pict file图象文件。本文件包括每一个参数的channel separation，灵敏度测试的结果，以及当前的FACSComp的仪器设置。Summary Report File的保存位置是：BD File：FACSComp File：DDMMYY folder。

? HLA-B27 Summary Report File

HLA-B27调试后同样生成两个Summary Report File：文本文件和图象文件，文本文件包括调节FL1和FSC之后仪器的设置。保存位置是：BD File：FACSComp File：DDMMYY folder。 ? Calibration File

FACSComp每一次运行结束都会生成一个新的calibration file，这个文件包括所有的仪器设置以及灵敏度测试的总的结果（TRUE代表所有的参数都通过，FALSE代表一个或几个参数不通过）。这个新生成的文件会自动覆盖原有的文件，因此每一次只会有一个Calib File和一个Calib File.LNW存在。保存位置是：BD File：Instrument Settings File。Lyse/Wash calibration file中仪器的设置可应用于SimuSET，Retic-COUNT；而Lyse/No Wash calibration file中仪器的设置可应用于MultiSET，TriTEST，ProCOUNT和FASTIMMUNE。

? HLA-B27 Calibration File

在进行HLA-B27调试之前，必须通过一次成功的Lyse/Wash Assay，而每一次调试结束后，都会生成一个新的HLA-B27 calibration file。保存位置是：BD File：Instrument Settings File。 ? LeucoCOUNT Calibration File

FACSComp可以对Lyse/No Wash的设置加以修饰生成LeucoCOUNT calibration file，因此，若要保存LeucoCOUNT Calib File，必须通过一次成功的Lyse/No Wash Assay，并且在参量设定时选择LeucoCOUNT。保存位置是：BD File：Instrument Settings File。 ? Target File

Target file是文本文件，包括了CaliBRITE beads的靶值，这些靶值可以通过选择FACSComp Menu下的Edit Target Values进行编辑，但是除非有BD公司的正式通知，否则不要改动这些靶值。保存位置是：BD Application：FACSComp Folder。

HLA-B27同样可以生成Target File，但是这个文件却是不能编辑的。 ? Target Value Log File

Target Value Log File记录了每一次编辑Target Values的操作人、日期以及每一个值。文件可以按照时间的顺序记录100次，因此对于观察

TargetValues的变化提供了一个极好的历史记录。该文件不能打开及查看，但可以在FACSComp中打印。保存位置是：BD Application：FACSComp Folder。 ? Levey-Jennings Summary Report Database File

LJ Data File包存了30次或60次FACSComp的Summary Report中所有的数据。你可以根据这些数据来监控一段时间内仪器的工作状态是否稳定。保存位置是：BD Application：FACSComp Folder。

? Optimization File

Optimization File保存了优化后的仪器设置，FACSComp为保存优化的仪器设置提供了5个不同的文件，你可以从Optimization 视窗直接进入这些文件及相对应的图中。 7.2 FACSComp的功能

? 光电倍增管（PMT）电压的调节

光电倍增管可以有多种电压设置，而电压设置的不同将影响到它的探测灵敏度，增大电压也就意味着信号的放大和channel值的增高。

FACSComp首先根据FSC的强度设一个上限和一个下限来减小双联体（两个bead粘在一起）和碎片的影响，然后根据unlabeled-beads所对应的Target Value来调节SSC、FL1、FL2和FL3 PMT的电压，使它们的平均值在Target Value±2的范围内。由于FL4几乎探测不到Unlabeledbeads的自发荧光，因此FL4 PMT的电压必须通过APC beads所对应的靶值来调节。FSC探测器是一个光电二极管，没有可连续变化的电压，因此也不存在FSC的target channel 。

软件还设定了阈值，例如，对于Lyse/Wash Assay设定FSC的阈值为52；对于Lyse/No Wash Assay，设定FL3的阈值为300，然而，这些阈值在FACSComp运行过程中不会用到，并且是可以改变的。 ? 荧光补偿的调节

应用于流式细胞仪上的大多数荧光染料的发射波谱都会发生叠加，光学滤镜可以最大限度地减小这些信号的叠加，但却不能消除。FACSComp可以用FITC-、PE-、PerCP-、APC-以及unlabeled-beads的混合物来调节荧光之间的补偿，而这补偿是通过调节电路来实现的。

FL1-%FL2 从FL1探测器中减去PE的信号 FL2-%FL1 从FL2探测器中减去FITC的信号