流式细胞仪SOP - 图文

流式细胞仪测定常用的荧光染料有多种,他们分子结构不同,激发光谱和发射光谱也各异,选择荧光染料时必须依据流式细胞仪所配备的激光光源的发射光波长(如氩离子气体激光管,它的发射光波488nm,氦氖离子气体激光管发射光波长633nm）。488nm激光光源常用的荧光染料有FITC（异硫氰酸荧光素）、PE（藻红蛋白）、PI（碘化丙啶）、CY5（化青素）、preCP(叶绿素蛋白)、ECD(藻红蛋白-得克萨斯红)等。他们的激发光和发射光波长分别是： 激发光波长（nm） 发射光波长（nm） FITC 488 525（绿） PE 488 575（橙红） PI 488 630（橙红） ECD 488 610（红） CY5 488 675（深红） PreCP 488 675（深红）

各种荧光信号由各自的光电倍增管(PMT) 接收并转变为电信号后存储在流式细胞仪的计算机硬盘或软盘内。

5、信号存储、显示、分析系统

(一) 信号存储

存储在流式细胞仪的计算机硬盘或软盘内的数据一般是以List mode(列表排队)方式存入的,采用List mode方式有两大优点:①节约内存和磁盘空间②易于加工处理分析。

（二）信号显示和分析

由于List mode方式数据缺乏直观性，数据的显示和分析一般采用一维直方图、二维点阵图、等高线图和密度图。

1．单参数数据显示和分析 细胞的每一个单参数测量数据用直方图来显示，图中横坐标表示散射光或荧光信号相对强度值，其单位是道数，可以是线性的，也可以是对数的；纵坐标表示细胞数。

2.双参数数据显示和分析 细胞的双参数测量数据和细胞数量的关系用一维直方图、二维点阵图、等高线图和密度图显示和分析。

3．三参数数据显示和分析 细胞的三参数测量数据和细胞数量的关系每两个数据组成一对（三参数测量数据和细胞数量每两个数据可组成6对数据）用一维直方图、二维点阵图、等高线图和密度图显示和分析。三个荧光数据关系用分光图（prism）表示，分光图可直接给出8个数据（如用ABC代表3种荧光，可有A+B+C+、A+B+C- 、A+B-C-、 A-B+C+、 A-B+C-、 A-B-C+、 A+B-C+ 、A-B-C-）。

6、细胞分选系统

如在细胞流动室上装有超声压电晶体,通电后超声压电晶体发生高频震动，

可带动细胞流动室高频震动,?使细胞流动室喷咀流出的液流束断成一连串均匀的液滴, 每秒钟形成液滴上万个。每个液滴中包含着一个样品细胞,?液滴中的细胞在形成液滴前已被测量,如符合预定要求则可被充电,在通过偏转板的高压静电场时向左或向右偏转被收集在指定容器中,?不含细胞液滴或细胞不符合预定要求液滴不被充电亦不发生偏转进入中间废液收集器中,从而实现了分选。?

四、BD FACSCalibur基本结构

1. 电源开关：在BD FACSCalibur仪器右侧下方，先启动仪器本体，再打开计算机。

2. 光学系统：BD FACSCalibur 基本配有一支波长488 nm 的氩离子雷射。以BD FACSCalibur 基本型为例

? FSC Diode 只收488 nm波长散射光 ? SSC PMT 只收488 nm波长散射光

? FL1 PMT 荧光光谱峰值落在绿色范围（波长515-545 nm） ? FL2 PMT 荧光光谱峰值落在橙红色范围（波长564-606 nm） ? FL3 PMT 荧光光谱峰值落在深红色范围（波长 >650 nm）

3. 仪器面板：仪器前方面板的右下方有三个流速控制键、及三个功能控制键。

流速控制： LO： 样品流速：12 ?l /min

MED： 样品流速：35 ?l /min HI： 样品流速：60 ?l /min

功能控制：

? RUN：此时上样管加压，使细胞悬液从进样针进入流动室。（正常显

示绿色；黄色时表示仪器不正常，请检查是否失压。）

? STANDBY：无样品或暖机时之正常位置，此时鞘液停止流动，雷射功率

自动降低。

PRIME：去除流动室中的气泡，流动室施以反向压力，将液流从流动室冲入样品管，持续一定时间后，以鞘液回注满流动室。PRIME束，仪器恢复STANDBY状态。

4. 储液箱抽屉：

在主机左下方之储液箱抽屉。可向前拉开，内含鞘流液筒、废液筒、鞘液过滤器Sheath Filter，及空气滤网 Air filter。请注意气路减压阀VENT TOGGLE之位置。

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鞘液筒：位于抽屉左侧，容积4升。装八分满鞘液筒，仪器可以运行大约 3小时。筒上装有液面感应器，鞘液用完时，仪器软件上会有显示。鞘液筒盖上有金属环扣，保证鞘液筒密闭。

废液筒：位于抽屉右侧，容积4升。筒上装有液面感应器，废液盛满时，仪器软件上会有显示。注意废液可能有潜在的生物传染性。

鞘液过滤器：0.22?m过滤器，去除鞘液中的杂质，保证进入流动室的鞘液是干净的。

气路减压阀：沿箭头方向移动阀门开关，鞘液筒减压，气压恢复正常。在鞘液筒添加鞘液时，需要减压。

空气过滤网：用于过滤冷却雷射的空气。

5. 上样品区：

上样品区是样本管的上样位置。它包括三个部分，一个是进样针 Sample Injection Tube，将样本输入流动室，还有就是支撑架 Tube Support Arm、和液滴存留系统 Droplet Containment System。

进样针：是一根不锈钢管，将细胞从样本针中吸入流动室。进样管外有一套管，是液滴保留系统的一部分。