胞内门冬酰胺酶实验讲义（中文版） - 图文

2、 再在上清液中加入13.6 g硫酸铵至90 %饱和度，调pH至等电点附近（约 pH

5.0），搅拌60 min，4 ℃静置过夜， 6000 rpm离心30 min，收集沉淀冻存。

【思考题】

1. 形成包涵体的原因有哪些？

2. 两次硫酸铵沉淀的目的分别是什么？

实验四 重组门冬酰胺酶II的透析脱盐

【实验目的】

1．了解重组门冬酰胺酶II通过透析法脱盐的原理 2. 掌握透析法的基本操作

【实验原理】

透析法是利用小分子物质在溶液中可通过半透膜，而大分子物质不能通过半透膜的性质，达到分离的方法。例如分离和纯化皂甙、蛋白质、多肽、多糖等物质时，可用透析法以除去无机盐、单糖、双糖等杂质。反之也可将大分子的杂质留在半透膜内，而将小分子的物质通过半透膜进入膜外溶液中，而加以分离精制：透析是否成功与透析膜的规格关系极大。透析膜的膜孔有大有小，要根据欲分离成分的具体情况而选择。透析膜有动物性膜、火棉胶膜、羊皮纸膜（硫酸纸膜）、蛋白质胶膜、玻璃纸膜等。油常多用市售的玻璃纸或动物性半透膜扎成袋状，外面用尼龙网袋加以保护，小心加入欲透析的样品溶液，悬挂在清水容器中。经常更换清水使透析膜内外溶液的浓度差加大，必要时适当加热，并加以搅拌，以利透析速度加快。为了加快透析速度，还可应用电透析法，即在半透膜旁边纯溶剂两端放置二个电极，接通电路，则透析膜中的带有正电荷的成分如无机阳离子、生物碱等向阴极移动，而带负电共荷的成分如无机阴离子、有机酸等则向阳极移动，中性化合物及高分子化合物则留在透析膜中。透析是否完全，须取透析膜内溶液进行定性反应检查。

【实验材料】 1 试剂

磷酸缓冲液（pH 6.4） 2%(W/V)碳酸氢钠

1mmol/L EDTA(pH 8.0)

2 仪器 透析袋 大烧杯

磁力搅拌器 微量移液器

【实验方法】

上一次实验收集的沉淀物用10 ml 5 mmol/L 磷酸缓冲液（pH 6.4）溶解并透析脱盐。

1 透析袋的预处理方法

透析袋的规格：截留分子量12000-14000。 1、 把透析袋剪成适当长度（15cm）的小段。

2、 在300 ml的2%(W/V)碳酸氢钠和 1mmol/L EDTA(pH 8.0)中将透析袋煮沸10分钟。

3、 用蒸馏水彻底清洗透析袋。

4、 放在200 ml 1mmol/L EDTA(pH 8.0)中将之煮沸10分钟。

5、 冷却后，存放于4度，必须确保透析袋始终浸没在溶液内。从此时起取用透析袋是必须戴手套。

6、 在使用之前，将透析袋内装满水然后排出，将之清洗干净。

2 透析

夹好夹子，检查透析袋是否漏，不漏用移液枪将门冬酰胺酶II的粗品装进透析袋，用5 mmol/L磷酸缓冲液透析。

刚开始20—30min换一次透析液，三四次后可以延长时间，透析8h或过夜。 上柱前将总体积调整到20ml，留样1m用于蛋白含量、酶活性及SDS-PAGE电泳分析。

【思考题】

影响透析效果的因素有哪些？

实验五 重组门冬酰胺酶II的初步鉴定

【实验目的】

1．了解离子柱交换吸附技术的原理

2．掌握离子柱交换吸附技术分离、纯化重组门冬酰胺酶II的方法。 3. 学习通过奈氏试剂测定重组门冬酰胺酶II的酶活力。

【实验原理】

离子交换色谱法是利用离子交换原理和液相色谱技术的结合来测定溶液中阳离子和阴离子的一种分离分析方法。凡在溶液中能够电离的物质通常都可以用离子交换色谱法进行分离。现在它不仅适用于无机离子混合物的分离，亦可用于有机物的分离，例如氨基酸、核酸、蛋白质等生物大分子，因此应用范围较广。

DEAE-纤维素柱层析分离是一种离子交换色谱。原理是：带电的生物大分子和离子交换色谱填料上的离子基团进行交换而被分离纯化。以离子交换剂为固定相，依据流动相中的组分离子与交换剂上的平衡离子进行可逆交换时的结合力大小的差别而进行分离。

【实验材料】 1. 试剂

磷酸缓冲液 (pH 6.4 ） DEAE-52阴离子纤维素 0.5M NaOH 0.5M HCl

硼酸缓冲液（pH 8.4） 三氯乙酸 奈氏试剂

2．器材 微量移液器 层析柱 层析架 蠕动泵

自动部分收集器

真空泵和真空干燥器 记录仪

【实验方法】 1 预处理

新的DEAE-52预溶胀型离子交换纤维素，无需进行预处理。

2 装柱

2.1 交换剂悬浮液的准备

1、 取预溶胀的10 g DEAE52粉末，加入到50 ml 5mmol/L 磷酸缓冲液 (pH 6.4 ）缓冲液中，放置10min，倾出上清液中的细小颗粒。

2、 重复处理直到滤液或上清液与缓冲液的pH相同为止。

2.2 装柱

将层析柱清洗干净垂直固定到层析架上，加1/3体积的无离子水，打开下出液口，水流畅通，即刻将小烧杯中的介质轻轻倒入层析柱中，介质自然慢慢沉降在层析柱底部，凝胶沉积直到离层析柱上端1.5-2cm处，停止装柱。层析柱上端进液口连接恒流泵，下出液口连接蛋白质监测仪，待层析柱的平衡。 2.3 平衡

利用层析柱上端的恒流泵将平衡缓冲液泵入到层析柱内，打开层析柱下端的出口，平衡液流速在0.5-1ml/min，当下出口流出液的PH值与平衡缓冲液的PH值一致时，层析柱达到了平衡。在本实验中， DEAE-纤维素柱子经过5mmol/L磷酸缓冲液（pH 6.4）平衡。

3上样、洗脱 3.1上样:

将洗脱酶液上样，用5 mmol/L磷酸缓冲液洗脱杂蛋白至基线平衡。 3.2 洗脱

1、 将梯度洗脱器和层析柱连接好。

2、 在洗脱瓶A（贮存器）和洗脱瓶B（混和器）内各装入0.2 mol/L磷酸缓冲液（pH 6.4）和50 mmol/L磷酸缓冲液（pH 6.4），注意两洗脱瓶，特别是液面应处于同一水平面，同时应排除连接管内气泡。

3、 开动电磁搅拌器开关，调节搅拌速度，以混和器内缓冲溶液旋转而无明显漩涡为宜。

4、 将两瓶和柱上下连接管道打开，开始收集洗脱流出液，控制流速在5ml/5min，每管收集5ml。 3.3 结果和计算:

收集合并酶活性组分，测量活性组分总体积，留样1ml用于蛋白含量、酶活性及SDS-PAGE电泳分析（用于SDS-PAGE分析的样品需取自峰尖）。 计算蛋白回收率、酶活回收率、纯化倍数。

4 介质再生

每个班级完成洗脱后，需将介质再生处理后，留给下一个班级使用。

1、 从层析柱中将离子交换剂倒入烧杯中，添加500ml 0.5M NaOH轻轻搅动，浸泡30min。

2、 滤出上清液，用水洗至下列pH 8.0。

3、 再加入500ml 0.5M HCl轻轻搅动，放置30min，滤出上清液，用水洗至下列pH 4.0。

4、 再次向烧杯中添加500ml 0.5M NaOH轻轻搅动，浸泡30min，滤出上清液，用水洗至下列pH8.0。

5、 用去离子水冲洗，砂心漏斗抽滤。用20%酒精溶液保存。

5 酶活力测定

氨与奈氏试剂反应生成黄色配合物，其吸光度与氨浓度成正比，故可用以测定门冬酰胺酶的活力大小。 反应式: NH3·H2O+2K2HgI4 + 3KOH→HgO·HgNH2I +7KI + 3H20