胞内门冬酰胺酶实验讲义（中文版） - 图文

实验二 重组表达门冬酰胺酶II工程菌的初步鉴定

【实验目的】

1. 了解原核细胞表达重组蛋白载体的原理 2. 掌握重组质粒的初步鉴定方法

【实验原理】

酶切、回收后的PCR产物与载体的连接：摩尔比的计算，回收的载体片段：回收的PCR产物片段=1：3到1：10，一般取前者0.03pmol，后者取0.3pmol。pmol为单位的DNA转换为μg单位的DNA：（X pmoles×长度bp×650）/ 1，000，000 （注：长度bp×650是该双链DNA的分子量）所得数值即为μg，也可以直接用这个公式套。1pmol 1000bp DNA=0.66μg，如载体是5380bp，则0.03pmol为0.03×5.38×0.66=0.106524μg。DNA浓度测定可使用微量可见光分光光度计，注意OD值，一般约1.7-1.9，而其对连接酶单位的定义为：在20 μl的连接反应体系中，6 μg的λDNA-Hind III的分解物在16℃下反应30分钟时，有90%以上的DNA段被连接所需要的酶量定义为1个活性单位（U）。而它的浓度为350 U/μl ，所以完全够用。连接酶容易失活，注意低温操作，最好在冰上。时间3个小时足已。

感受态细胞（competent cell）：理化方法诱导细胞，使其处于最适摄取和容纳外来DNA的生理状态。在分子生物学实验中，细胞通过特殊处理后可变成感受态细胞(competent cells)，即可以接受外源DNA。将构建好的载体转入感受态细胞进行表达，不仅可以检验重组载体是否构建成功，最主要的是感受态细胞作为重组载体的宿主可以进行后续实验，如蛋白质表达纯化等工作。有两种常用方法：

电穿孔法(electroporation)：细胞与DNA混合；高电压脉冲；随后在富营养培养基内复苏。多用于对酵母细胞的转化。

化学方法：将细胞悬浮于0℃的氯化钙溶液中，并加入外源DNA（一般为质粒），混合后放置约半小时；短暂（一般为75－90秒）升温至42℃（即热休克）；加入富营养培养基以进行复苏。该方法一般用于对原核细胞，特别是大肠杆菌的转化。

CaCl2法：1.将快速生长的大肠杆菌置于经低温（0℃）预处理的低渗氯化钙溶液中，便会造成细胞膨胀，同时Ca2+会使细胞膜磷脂双分子层形成液晶结构，促使细胞外膜与内膜间隙中的部分核酸酶解离开来，离开所在区域，诱导细胞成为感受态细胞 细胞膜通透性发生变化，极易与外源DNA相粘附并在细胞表面形成抗脱氧核糖核酸酶的羟基－磷酸钙复合物。2.此时，将该体系转移到42℃下做短暂的热刺激（90s），细胞膜的液晶结构会发生剧烈扰动，并随机出现许多间隙，外源DNA就可能被细胞吸收。进入细胞的外源DNA分子通过复制、表达，实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性状。3.将转化后的细胞在选择性培养基上培养，筛选出带有外源DNA分子的阳性克隆。

【实验材料】 1. 试剂 连接试剂盒 大肠杆菌Bl21

LB 液体培养基 LB 固体培养基 氨苄青霉素(Amp) CaCl2溶液 2．器材 微量移液器

标准净化工作台 恒温水浴锅 冷冻离心机

Eppendorf离心管架 灭菌的移液器枪头

灭菌的Eppendorf管（1.5ml微量离心管） 摇床

分光光度计 制冰机

恒温培养箱

电磁搅拌器 酸度计

【实验方法】 1 连接体系

在PCR管中按照下列体系连接

T4 DNA Ligase ( 400 U/μl，NEB ) 10×Ligase buffer Plasmid PCR product

Nuclease-Free Water to final volume

0.5 μl 2 μl

50~100 ng 50~100 ng 20 μl

冰上3h或者16℃恒温过夜。当质粒和PCR产物的含量相当时，两者的末端摩尔浓度比例在1：5左右。

2 转化

2.1 大肠杆菌感受态的制备(CaCl2 法)

提前将大肠杆菌Bl21（DE3）划线分离单菌。从甘油管中取300 μl ，接种到LB液体培养基中，培养过夜。第二天按照1:50的比例，转接到100 ml LB培养基中，当OD600达到0.5-1.0之间时，按照以下流程制备感受态细胞：

1、将1.5ml菌液移入离心管中，冰上放置10分钟，然后于4℃下，5000 rpm离心5分钟。

2、弃去上清（轻轻倾倒掉上清液，并用移液器移除残余的过多水分）。

3、加入1ml预冷的0.05 mol/L的CaCl2溶液，轻轻拨动管底使细胞完全悬浮,冰上放置15分钟，4℃下5000 rpm离心5分钟。

4、弃去上清，加入0.2ml预冷的0.05 mol/L 的CaCl2溶液, 轻轻悬浮细胞，即制成感受态细胞。将感受态细胞悬液分装成2份，每份100μl（注意悬液密度要均匀）。冰上放置备用。（每组制备4份）

5、暂时不用的感受态细胞可置于-80℃保存。

注：CaCl2处理后的细胞比较脆弱，尽量温柔操作。 2.2 连接产物的转化

1、 用无菌吸头分别向3管100 μl感受态细胞中加入10 μl连接产物、10μl去离子水（阴性对照）和1μl pET22b空载体（阳性对照），轻轻旋转或轻弹管壁以混匀内容物，在冰上放置30 min；

2、 将管放到42 ℃水浴中热激90 s，不要摇动离心管； 3、 快速将离心管转移到冰浴中，冷却1-2 min； 4、 每管中加入800 μl LB液体培养基后，37 ℃振荡培养1 h； 5、 吸取100 μl已转化的感受态细胞加到含选择抗性LB平板上，用L型玻璃棒轻轻地把细胞均匀地涂到琼脂平板表面；

6、 倒置培养皿于37 ℃培养12-16 h，观察单菌落拍照。

【思考题】

1 转化实验中设立的阴性对照和阳性对照分别用于验证什么问题？ 2导致重组质粒PCR结果为阴性的原因有哪些？

实验三 重组门冬酰胺酶II的诱导表达及分离和纯化

【实验目的】

1. 了解重组工程菌发酵培养、诱导表达重组门冬酰胺酶II的原理。 2. 掌握硫酸铵分级沉淀的方法

【实验原理】

发酵：多指生物体对于有机物的某种分解过程。发酵是人类较早接触的一种生物化学反应，如今在食品工业、生物和化学工业中均有广泛应用。其也是生物工程的基本过程，即发酵工程。对于其机理以及过程控制的研究，还在继续。发酵是这样一种生物氧化方式：在没有外源最终电子受体的条件下，化能异养型微生物细胞对能源有机化合物的氧化与内源的（已经经过该细胞代谢的）有机化合物的还原相耦合，一般并不发生经包含细胞色素等的电子传递链上的电子传递和电子传递磷酸化，而是通过底物（激酶的底物）水平磷酸化来获得代谢能ATP；能源有机化合物释放的电子的一级电子载体NAD，以NADH的形式直接将电子交给内源的有机电子受体而再生成NAD，同时将后者还原成发酵产物（不完全氧化的产物）。

盐析一般是指溶液中加入无机盐类而使某种物质溶解度降低而析出的过程。如：加浓（NH4）2SO4使蛋白质凝聚的过程；在乙酸的酯化反应中加入饱和碳酸钠溶液，降低乙酸乙酯溶解度，使其分层现象更明显的过程。向某些蛋白质溶液中加入某些无机盐溶液后，可以降低蛋白质的溶解度，使蛋白质凝聚而从溶液中析出,这种作用叫作盐析，是物理变化，可复原。向某些蛋白质溶液中加入某些重金属盐，可以使蛋白质性质发生改变而凝聚，进而从溶液中析出，这种作用叫作变性，性质改变，是化学反应，无法复原。

硫酸铵沉淀法可用于从大量粗制剂中浓缩和部分纯化蛋白质。原理是：高浓度的盐离子在蛋白质溶液中可与蛋白质竞争水分子，从而破坏蛋白质表面的水化膜，降低其溶解度，使之从溶液中沉淀出来。各种蛋白质的溶解度不同，因而可

利用不同浓度的盐溶液来沉淀不同的蛋白质。

【实验材料】 1. 试剂

LB液体培养基 发酵培养基（玉米浆培养基）：玉米浆50g/L，牛肉浸膏35g/L，味精10g/L， pH7.0，高压灭菌。接种前在无菌条件下加入抗生素氨苄青霉素。

破壁液：45%蔗糖，10 mmol/L EDTA，200mg/L溶菌酶，pH 7.5 醋酸钠缓冲液（pH 5.6） 硫酸铵

2．器材

微量移液器 磁力搅拌器 酸度计

旋涡混合器 超声波破碎仪

【实验方法】 1 破碎细胞 1.1细菌的培养

用于蛋白分离纯化的重组菌所含质粒是pET22b-AnsB。 发酵条件：

1、 种子菌培养：从甘油管中取400 μl菌液接种到50ml LB液体培养基中（含Kanamycin 50 μg/ml ），37℃摇床中（150 rpm）培养12h。

2、 取10 ml种子液体，接入到装有200 ml玉米浆质培养液的500 ml三角瓶中，25 ℃摇床中（150 rpm）培养4h后，加入乳糖至终浓度为10 mmol/L（200ml 中加入4ml 0.5mol/L的乳糖），培养过夜。

3、 在4 ℃下，6000 rpm离心15min收集菌体。 1.2超声波破碎

取用1g菌体，用20 ml 20mmol/L 的醋酸钠缓冲液（pH 5.6）重悬。 超声破碎条件：

1、 冰浴破碎20min每破碎15 S后暂停30 S，功率400W。

2、 为使液体温度不至于过高，破碎的全部过程，含有细胞悬液的离心管应置于冰水混合物中。

3、 6000 rpm离心15min，取上清液作为粗酶提取液。 留样1ml用于蛋白含量、酶活性及SDS-PAGE电泳分析。

2 蛋白质粗提取（硫酸铵分级沉淀第一次） 加入缓冲液，将酶提取液的体积放大至50ml，在酶提取液中加入18.1g硫酸铵至55%饱和度，调pH至7.0，冰水浴磁力搅拌60 min，4 ℃沉淀3h

3 硫酸铵分级沉淀第二次

1、 将第一次硫酸铵分级沉淀的产物6000 rpm离心20 min除去沉淀。