现代分子生物学实验指导

4.4.2 调节好天平。

4.4.3 来回吸吹蒸馏水3次，以使吸头湿润，用纱布拭干吸头。

4.4.4 垂直握住加样器，将吸头浸入液面2-3mm处，缓慢（1-3s）一致地吸取蒸馏水。

4.4.5 将吸头离开液面，靠在管壁，去掉吸头外部的液体。

4.4.6 将加样器以30角放入称量烧杯中，缓慢一致地将加样器压至第一档，等待1-3s，再压至第二档，使吸头里的液体完全排出。

4.4.7 记录称量值。 4.4.8 擦干吸头外面。 4.4.9 按上述步骤称量10次。

4.4.10 取10次测定值的均值作为最后加样器吸取的蒸馏水重量，按蒸馏水在不同温度及气压下的重量与体积的换算因子计算体积。然后，按校准结果调节加样器。

4.5加样器的维护保养程序

加样器应根据使用频率进行维护，但至少应每3个月进行一次，具体方法如下：

4.5.1.一般维护可用中性洗涤剂清洁，或者用60﹪的异丙醇，然后用蒸馏水反复洗涤，去除洗涤剂或异丙醇，晾干。清洁后活塞处可使用一定量的润滑剂。

4.5.2.如果有液体进入加样器内的严重污染，可将加样器拆开后进行清洁，具体拆开步骤参照加样器说明书。

4.5.3.高压消毒，有的加样器的吸管部分可高压消毒，但需注意的是消毒时不可超温超时，也不能挤压放置，以免造成变形。

4.5.4.可调式移液器在不使用时应妥善地竖立放于支架上，远离潮湿及腐蚀性物质。

4.5.5.在移液操作过程中为防止液体进入加样器套筒内，必须注意：压放按钮时保持平稳；加样器不得倒转；吸头中有液体时不可将加样器平放。

4.5.6.每天开始工作之前应检查移液器的外表面是否有灰尘或污物，若有则小心抹去。

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实验一大肠杆菌的对照培养、单菌落的分离及菌种保

存

大肠杆菌(Escherichia coli)是分子遗传学实验、基因工程操作中广泛采用的一种受体菌，它的遗传背景研究的比较详细，常用做寄主进行基因扩增及外源基因的表达。

一、实验原理

大肠杆菌除本身的核染色体外，往往还含有质粒(Plasmid)DNA，这是一种双链闭合环状的DNA分子，大小在1Kb-200Kb左右，通常质粒DNA带有利于细菌在某一特定环境下生存的酶的基因，而使寄主菌表现以下一些表现型:

1．对抗生素的抗性 2．产生抗生素 3．降解有机复合物 4．产生大肠杆菌素 5．产生内毒素 6．产生限制修饰酶

pET32a质粒上带有一个与大肠杆菌抗氨苄青霉素(Ampecillin)有关的基因，它能编码一种β-内酰胺酶，这种酶降解氨苄青霉素，从而消除了抗生素对细胞壁 形成的抑制作用，不含这种质粒的细菌则不能在含抗生素的培养基上存活。

二、设备仪器及设备

超净工作台、恒温培养箱、高压灭菌锅、酒精灯、移液枪

三、实验材料

菌株：E．coli，E．coli (pET32a)

耗材：细菌培养皿（60 cm）、牙签或者接种环、称量纸、250 ml 锥形瓶 10个、细菌过滤器、5 ml注射器、100 ml烧杯2个

试剂：无菌水、10 N的NaOH、琼脂、酵母抽提物、胰蛋白胨、 NaCl、氨苄青霉素。

四、实验步骤

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1. 配制培养基：

LB (Lurib-Bertani) 液体培养基：酵母抽提物 (Yeast extract) 0.5 g；胰蛋白胨

(trytone) 1 g；NaCl 1 g，加蒸馏水80 ml，溶解后加入10 N的NaOH 30 μl调节pH值至7.0，定容至100 ml。

LB固体培养基：在上述液体培养基中，按15 g/L加入琼脂，然后灭菌即成固体培养基。

50%的丙三醇（甘油）: 取50ml丙三醇加入50ml ddH2O至100 ml。

将上述培养基、丙三醇溶液、50 ml离心管及1.5 ml离心管、牙签 高温蒸汽消毒15磅20 min 2. 配制氨苄青霉素：

Amp（100 mg/ml）：称取100 mg Amplicillin溶于1ml去离子水中，完全溶解后用0.2 μm滤膜过滤除菌，-20℃保存，用时1000倍稀释。（在灭菌期间开展） 3. 倒平板

将固体培养基加热至充分熔化，待温度降至50℃以下凝固前，1 瓶100 ml的固体培养基先倒2~3块板，不添加抗生素；另外两瓶加入Amp 至100 ug/ml摇动混匀，每平皿倒入25ml 左右，此过程应进行无菌操作。 4. 划线接种

待培养基凝固以后，用接种环(灼烧消毒后)分别接种各一环贮存菌种：E. coli和E. coli (pET32a)于不含Amp的LB 平板上和含Amp 的LB平板上,划线接种，防止划破培养基。第一次划线后接种环灼烧第二次划线起点第一次如此在平板上再进行第二次划线交叉，接种环灼烧后再划线 5-6 次进行第三次划线。 5. 培养

接种完成后将培养皿倒置入培养箱37℃培养过夜，运用这种划线方法接种，可以较好地保证单菌落的形成。（次日周三上午需要将平板用parafilm封口，放在4度冰箱保存）

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6. 克隆挑取 （下周一5:00-6:00?）

挑取E.coli (pET32a)的单菌落分别接种至含Amp的5ml LB液体培养基中，37℃振荡培养过夜。（周二上午9:00从培养箱中取出来，放在4度冰箱，下午用于抽提质粒） 7. 菌种保存

分别吸取0.5 ml菌液在无菌条件下，加入0．5 ml 50%丙三醇，置一灭菌的离心管中，混匀至-20℃保存。

六、思考题:

1.培养大肠杆菌需要配制培养基，培养基中应该添加哪些营养成分？培养基如何

灭菌？

2.若大肠杆菌和其他微生物混杂在一起，如何获得大肠杆菌纯种？获得纯种后如

何保存？

3.如何处理大肠杆菌便于在显微镜下观察？ 4. 简述单菌落分离的接种过程。

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