现代分子生物学实验指导

13. 洗膜液：1 L TBST配制：100 mL 10×TBS+900 mL超纯水+1 mL Tween-20； 10×TBS：Tris 24.2g，Nacl 80g，水1L（PH≈7.6）

14. 转印缓冲液：Tris 15g，甘氨酸72g加水定容到1000mL，一般不需调节pH值，

用时稀释5倍到1×转印缓冲液。如果采用PVDF膜稀释过程中加20%甲醇，即20 mL的5×转印缓冲液，10 mL甲醇，然后定容到100 mL。

15．一抗溶液：ERK1/2及GAPDH（Cell Signaling Technology公司）抗体用封闭液

1：1000稀释使用。

16. 二抗溶液：HRP标记的羊抗兔的IgG用封闭液1：2000稀释使用。 17. SuperSignalWest Pico 化学发光底物（Thermo Pierce）

四、步骤： SDA-PAGE: 1．配置10%分离胶（两块胶用10mL）

组份表：水4mL，30%凝胶储备液3.3mL，1.5mol/LTris-HCl (pH8.8)2.5mL，10%SDS 0.1mL，10%过硫酸胺（催化剂，用作醋酸乙烯、丙烯酸酯等烯类单体乳液聚合的引发剂）0.1mL，TEMED（加速剂）0.004mL。

在烧杯内迅速搅拌均匀（TEMED最后加），用移液枪注入玻璃板间隙中，加入大约4mL（也可左手将玻璃板倾斜，右手拿烧杯从较长的一侧中部缓缓倒入）。用1 mL去离子水自左向右覆盖，去除气泡，防止胶被氧化。

聚合完成（约30min）后，倒掉覆盖液体，尽可能用吸水纸吸干顶端残存液体。 2．配置5%浓缩胶（凝胶电泳时，在分离胶上方铺设的一薄层大孔凝胶。能使样品在电泳初始阶段快速浓集在分离胶界面，样品在分离胶就能达到更好的分离效果。样品通过成层胶浓集是采用等速电泳的原理。)（两块胶用5mL ）

组份表：水3.4mL，30%凝胶储备液0.83mL，1.0mol/LTris-HCl (pH6.8) 0.63mL，10%SDS 0.05mL，10%过硫酸胺0.05mL，TEMED0.005mL

搅拌均匀，注入玻璃板内，分离胶的顶部。平稳插入梳子，垂直放置于室温下。

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3．装电泳槽：在成层胶聚合完成（约30min）后，用去离子水冲洗梳孔以除去未聚合的丙烯酰胺，将凝胶放入电泳槽上。上下槽均加入1×电泳缓冲液，检查是否泄漏（上一次电泳的缓冲液可以作为下槽的缓冲液，以便试剂的节约）。驱除两玻璃板间凝胶底部的气泡。

4．样品处理：在成层胶聚合的同时，样品与加样缓冲液（提前加入β-巯基乙醇）混匀，100℃加热5min。

5．上样：按次序上样，不同样品的上样体积用1×loading buffer调成一致，将1×Loading Buffer加入未使用的梳孔中。（本实验中使用的样品一样，点样顺序为，样品，样品，样品，marker，样品，样品，样品，marker，样品，样品）。 6．电泳：成层胶电压为90V，染料进入分离胶后，将电压增加到120V，继续电泳直到染料抵达分离胶底部，断开电源。（在电泳槽的底部有一条白金丝，清洗时注意不要损坏；在电泳槽正常工作的情况下，会有气泡产生，电泳开始一段时间后样品浓缩成一个窄带，此时方可离开做其他实验）。

7．染色：电泳结束后，切下两个泳道的胶用于进行SDS-PAGE电泳检测（其他的胶用于转膜）。用至少5倍体积的染色浸泡，放摇床上室温缓慢旋转30 min- 1h； 8．脱色：换掉并回收染液，用水洗去多余的染色液，用甲醇/醋酸溶液浸泡凝胶，缓慢摇动4~8h脱色，其间换液3~4次，直到胶的背景很淡时为止；

9．观察结果：将脱色后的凝胶照相或干燥，也可用封闭塑料袋在含20%甘油的水中长期保存。 注意事项：

1、丙烯酰胺有神经毒性，可经皮肤、呼吸道等吸收，故操作时要注意防护。 2、SDS-PAGE所得结果，在分子量为15,000—200，000的范围内，与用其他方法测得的分子量相比，误差一般在±10%以内，在此范围内结果才较为准确。 3、加样的量要合适，一个样品的0.25μg某种蛋白质，即可观察到其电泳带，而如果有20~100μg，该泳道便超载了。

4、对许多蛋白而言，电泳时速度越大则电泳带越清晰，但电流太大，玻璃板

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会因受热而破裂，故合适的电流应该是玻璃板热而不烫。

5、SDS-PAGE凝胶的考马斯亮蓝染色可检测到0.1μg以上的单一条带的蛋白质。 6、如欲更快脱色可用下述方法：

（1）用30%甲醇、10%乙酸混合液脱色，但脱色时间过长，蛋白质带的着色深度将会部分丧失；

（2）用正常的脱色液在45℃下脱色；

（3）正常的脱色液中加入数克阴离子交换树脂或一块海绵，吸附脱下来的染料；

（4）使用商品化的专门仪器电泳脱色；

（5）染色过的凝胶不应贮存在脱色液中，因这将导致蛋白质带褪色。 7、实验中的玻璃器皿必须干净并用无离子水冲洗，否则，可大大减低银染的灵敏度。

8、为保存凝胶，将染色后的凝胶放在玻璃纸上，并在凝胶上面覆盖一层玻璃纸。这样干燥出来的直接用于照相、摄影或永久保存，效果甚佳。

Western Blot-转印： 1. 拨胶：Tris/甘氨酸-SDS-PAGE结束后，取出凝胶，在Tris/甘氨酸缓冲液中漂洗数秒。取凝胶方法：用胶将两玻璃板分开，将多余的凝胶划去，上部以浓缩胶为准全部弃去，下部以分子量标准最小分子带下一点全部划去，在流水下将拨胶板插入玻璃板与凝胶之间注水，使水的压力将两者自然分开，缓慢小心操作，直至凝胶从玻璃板上滑落下来。

2. 准备转印膜及滤纸：将PVDF膜剪裁稍大凝胶一点，滤纸切出与凝胶一样大小，置转移缓冲液中湿润5-10 min。

4. 准备半干转印仪：插上半干转印仪的电源，打开仪器开关，用双手按住仪器两段的上面的按钮，手指向上抬，拿下半干转印仪上面的阳极电极板。

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5. 转印操作：按照以下（半干转由下至上）最底层(7)—滤纸(6)—PVDF膜(5)—胶(4)—滤纸(3)—盖子(2)。每一层需用试管轻轻在上一层滚动去除气泡。盖好加上阳极电极板。使用试管时沿同一方向滚动。盖上盖子时，maker放置在左边。

6. 设置电压 V、电流 A。根据膜面积设定电流，整块胶限制电流1.3A，1.5cm×8cm胶两条限制电流1.3A，恒定电压25V。

7. 转膜结束后，将膜取下封闭，关掉电源开关，拔下电源，并清洁半干转印仪。 注意事项：

1. 一定按照上述顺序放置转膜装置，胶在负极，膜靠近正极； 2. 滤纸与膜、胶的尺寸大小相近；

3. 夹好膜和凝胶后，确定在凝胶/膜和滤纸之间没有气泡存在，否则会导致转膜不完全；

4. 注意一定要戴手套或用镊子接触膜，因为手上的蛋白和油脂会影响转膜效率并会使膜脏掉；

封闭、一抗杂交、二抗杂交

1. 转膜结束前，准备好与膜相应数量的洗膜盒并装好TBS，待用。转膜完成后，用镊子夹膜的边缘，通常夹maker处旁边，放入预先装好TBS的洗膜盒中，膜的正面右上角剪三角形进行标记。

2.封闭：膜用TBS漂洗2×5min后，把膜放入装有适量封闭液盒中，室温孵育30 min~2h，若当天不进行下一步可以4 ℃摇床封闭过夜。

3. 一抗杂交：倒掉封闭液，加入抗体孵育液，37℃孵育两小时或者4 ℃摇床过夜。（本实验做到这一步过夜操作）。

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