Pfu高保真酶常见问题

Pfu高保真酶常见问题

1.克隆型和天然型 Pfu DNA聚合酶有什么不同？

天然型Pfu 直接从热稳定性细菌Pyrococcus furiosus 纯化而来；克隆型Pfu 是从大肠杆菌中纯化得到的重组型产品。天然型和克隆型的Pfu 的PCR扩增基本特性和保真性基本一致，但是我们发现克隆型Pfu 的弥散背景与天然型相比更低。另外，Stratagene独有的专利Archaemaxx因子（与天然型Pfu共纯化得到）可以略微改善Pfu的操作性。

2. Pfu有什么扩增特点，最优化的延伸温度是多少？ 天然型和克隆型Pfu DNA聚合酶的延伸速度均为72℃，2 min/kb。PfuTurbo DNA聚合酶扩增小片段时，延伸速度为1 min/kb，长片段（如6-10 kb的基因组模板或10-15 kb的质粒DNA模板）则要求2 min/kb。

3.常见的一些PCR添加剂能和Pfu DNA聚合酶一起使用吗？

说明书中提到DMSO，甘油，甲酰胺，硫酸铵，Perfect Match和BSA都是可以使用的添加剂。但是保真性是否受影响却不一定。使用这些添加剂主要是提高酶的活性。

? DMSO：改善GC含量高的DNA的变性情况，使聚合酶更容易在二级结构区延伸，但是当浓度大于10%时会降低保真性。 ? 甘油：提高产量，增加酶的稳定性。 ? 甲酰胺：促进某些引物－模板退火，降低带有二级结构的DNA的变性温度。 ? 硫酸铵：增加反应体系的离子强度，改变DNA的变性及退火温度，调节酶活。

? Perfect Match：通过降低错配引物－模板的稳定性而提高PCR产物特异性；帮助去除二级结构使延伸进行得更顺利。

4. Pfu DNA聚合酶的错配率是多少？

PfuUltra和PfuTurbo 是目前市场上高保真最高的热稳定聚合酶，以每轮复制中出现的碱基突变检测，其错配率分别仅为4.3 x 10-7和1.3 x 10-6。

5.如何用Pfu DNA聚合酶扩增的产物进行TA克隆？

制备用于TA克隆的带有A尾巴的PCR产物最好选用Easy-A高保真PCR克隆酶。这个酶同时具有Pfu 的高保真性和末端转移酶活性。Pfu 的扩增产物也可以用于TA克隆，但是需要增加一步加尾反应以使产物带上A尾巴。具体做法是：取1-7μl纯化的PCR产物加上1 μl 10X Taq DNA聚合酶缓冲液（含有MgCl2），终浓度为0.2 mM的dATP，5u Taq DNA聚合酶，加蒸馏水至10 μl，70℃反应15-30min。取1-2 μl进行连接反应。不过，我们推荐直接用Easy-A做TA克隆。

6. Pfu DNA聚合酶95℃下稳定性如何？

Pfu DNA聚合酶95℃下1小时仍能保持95％的活性。

7. Pfu DNA聚合酶和Pfu Turbo之间有什么不同？ PfuTurbo是克隆型Pfu DNA聚合酶的改进产品，添加了一个特殊的聚合酶

增强因子，Archaemaxx。在PCR进行过程中，由于dCTP自发去氨基造成dUTP累积，进而导致Pfu 结合在模板上，PCR被阻滞。Archaemaxx是一种dUTPase，能将dUTP转为dUMP，使聚合速度加快达到1 min/kb （但6-19 kb的基因组模板和10-15 kb的质粒模板还是要2 min/kb）。PfuTurbo 的扩增能力有所提高还表现为能用于扩增更长的模板。从保真性来讲，Pfu和PfuTurbo 水平一致。

8. Pfu DNA聚合酶能扩增多大的片段？

克隆型和天然型Pfu DNA聚合酶扩增质粒模板可达10kb，基因组模板上限为6kb。PfuTurbo扩增质粒模板达15kb，而且已经扩增出长达19kb的基因组DNA。PfuUltra也成功地扩增了17kb的基因组模板。

9. Pfu Turbo和 Pfu Ultra的主要区别是什么？

主要差别是保真性不同。PfuUltra 比PfuTurbo保真性高3倍以上。两者的PCR反应参数基本一样。