作物分子育种

一、作物分子育种

作物育种基本任务：1.在研究和掌握作物形状遗传变异规律的基础上，发掘研究和利用作物种植资源；2.选育优良品种或杂种以及新作物；3.繁殖生产用种。

作物分子育种：即在经典遗传学和分子生物学等理论指导下，将现代生物技术手段整合于传统育种方法中，实现表现型和基因型选择的有机结合，培育优良新品种。

分子标记育种：又称为分子标记辅助选择，是利用与目标基因紧密连锁的分子标记，在杂交后代中准确鉴别不同个体基因型，从而进行辅助选择育种。特点：能有效结合基因型与表现型鉴定，显著提高选择的准确性。 干燥：用适量的TE溶解DNA；7.再次离心：DNA中的杂质和不溶物会沉于离心管底部，将上清转移到5ml的离心管中，管壁标记材料名称；8.检测DNA质量及浓度，放入冰箱。 DNA提取注意事项：1.提取材料尽量要幼嫩叶片；2.整个提取过程应低温，一般利用液氮、冰浴；3.当DNA处于溶解状态，尽量减弱溶液涡旋，动作要柔缓。

DNA降解的外源因素：1.外界物理因素：温度、湿度；2.化学因素：PH值、水解反应、氧化反应；3.生物因素：酶解及微生物侵染等作用。这些因素都直接与DNA的构型分子组成有关。

的模板。实际的引物与接头和酶切位点互补，并在3’加上2~3个选择性

碱基，因此在基因组被酶切后的无数片段中，只有一小部分限制性片段被扩增，即只有那些与引物3’端互补的片段才能进行扩增，称为选择性扩增。为了对扩增片段的大小进行灵活的调节，一般采用两个限制性内切酶。扩增产物经放射性同位素标记、聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，可产生数量丰富的带型标记，然后根据凝胶上DNA指纹的有无来检测多态性。分辨率高，是一种十分理想和高效的遗传标记。

所用的两种酶：酶切频率较高的限制性酶，酶切频率较低的稀有酶；（4个识别位点的Mse I,6个识别位点的EcoR I）

AFLP引物包括3部分：5’端的与人工接头序列互补的核心序列，限制性转基因育种：利用基因重组DNA技术，将功能明确的基因通过遗传转化手段导入受体品种的基因组，并使其表达期望形状的育种方法。特点：能打破基因不同物种交流障碍，克服传统育种的困难问题。 分子设计育种（刚起步）：目的——通过各种技术的集成与整合，在育种家的田间试验之前，对育种程序中的各种因素进行模拟、筛选和优化，确立目标基因型，提出最佳亲本选配和后代选择策略，提高育种试验可见性。 我国作物分子育种中存在的问题：1.基因资源挖掘力度有待加强；2.实用分子标记和具重要育种价值的基因十分贫乏；3.作物分子育种技术尚待突破；4.通过分子育种培育的突破性品种不多，产业化程度不高；5.作物分子育种的组织体系和实施机制需要创新。

作物分子育种意义：1.发展作物分子育种是保障国家安全的重大需求；2.全面实现作物分子育种相关技术突破；3.加速作物分子育种研发和产业化。

常规育种和分子育种比较：1.常规育种表现型选择时，会受时空因素影响，而分子育种不会；2.常规育种来源广，育种亲本贫乏；分子育种基因来源广，基因资源丰富。3.常规育种基因局限于种内，少数局限于亚种间；分子育种基因交流不受物种限制。4.常规育种目标性状有不明确性；分子育种目的基因功能已知，目标性状明确。5.最明显特征：常规育种选择时间长；分子育种选择时间短，可调控基因及其产物的功能、表达。

分子育种与传统育种关系：分是传的延伸和发展，二者是互补、嫁接、结合的关系，常规育种与分子育种形成了现代作物育种。

二、作物分子标记育种

遗传标记：指可追踪染色体，染色体某一节段，某个基因座在家系中传递的任何一种遗传特性。两个特点：可遗传性、可识别性。

在植物遗传育种研究中可被应用的遗传标记应具备以下四个条件：1.多态性高；2.最好表现为共显性，能够鉴别出纯合基因型和杂合基因型；3.对主要农艺性状影响小；4.经济方便，容易观察记载。 植物中常用的遗传标记：

形态学标记：即植物的外部形态特征，主要包括肉眼可见的外部特征，如：矮秆、紫鞘、卷叶等；也包括色素、生理特性、生殖特性、抗病虫性等有关的一些特性。

细胞学标记：即植物细胞染色体的变异：包括染色体核型（染色体数目、结构、随体有无、着丝粒位置等）和带型（C带、N带、G带等）的变化。 生化标记：利用电泳技术对蛋白质、酶等生物大分子进行鉴定。主要包括同工酶和等位酶标记。 分子标记

分子标记的类型：RFLP、RAPD、AFLP、SSR

分子标记：在生物系统和进化研究中，每个能反应遗传变异的，能提供系统学信息的多态位点称为一个分子标记，在遗传育种研究中每个与感兴趣的性状或目的基因链锁的多态性位点也称为一个分子标记。特点：1.表现稳定（DNA形式）；2.数量多；3.多态性高；4.表现中性，不影响目标性状表达；5.区别Aa和AA；6.成本不太高。

分子标记技术：能提供分子标记的分子生物学技术。特点（优点）：1.分子标记技术选用的分子信息比较稳定；2.提供遗传信息量是无限的；3.能很好区分同源性和相似性；4.能提供物种间比较共同的尺度；5.打开了遗传学研究的大门。

三、DNA

PEX（异基磺原甲酸）提取方法的具体步骤包括：1.研磨：加入液氮研磨后，放入液氮预冷的离心管，尽量用2ml管，研碎材料不超过离心管一半；2.水浴：加800ul的PEX提取液，充分混匀，65℃水浴45分钟，期间混匀3次，动作不能剧烈；3.离心：12000rpm室温离心10分钟，取灭过菌管，将上清液转入，再次离心；4.沉淀DNA：离心后上清液再次转移，在装有转入上清液的离心管中加1/10体积的3mol/l醋酸钠和1倍体积的异丙醇，混匀，放入-20℃的冰箱中至少沉淀30分钟；5.洗DNA：离心15分钟，倒掉上清液，70%酒精洗所得的DNA，分两次进行；6.室温四、植物DNA的分子和检测

在琼脂糖凝胶电泳中影响DNA迁移的因素：DNA分子质量、DNA分子构型、琼脂糖、凝胶浓度、电场强度、EB影响。

聚丙烯酰胺凝胶电泳电泳板的制备：①清洗电泳板②处理电泳板③组装电泳板④电泳板灌胶。电泳板灌胶是最关键的一步。

影响泳动速度的因素：①电场强度②缓冲溶液的PH③缓冲溶液的离子强度④电渗⑤焦耳热⑥筛孔

五、RAPD标记

RAPD标记技术的实验原理： RAPD标记技术的应用：①RAPD标记可用于植物亲缘关系及种质资源遗传多样性分析②RAPD标记构建分子标记遗传连锁图谱③对优异基因定位及优异性状的选择④构建DNA指纹图谱及品种鉴定⑤鉴定及标记外援染色体片段⑥分子标记辅助育种

RAPD标记技术的特点：1.优点：①RAPD标记技术中使用的随机引物，不需要预先了解目的基因和相应的序列，引物价格便宜，成本较低；②RAPD标记技术操作技术简单，试验周期短、能在较短时间筛选大量样品③选用引物没有种属限制④需要模板量较少⑤无需借助于有伤害性的同位素，耗费的人力物力少⑥灵敏度高⑦可以覆盖整个基因组⑧RAPD产物有大于50%的条带扩增于单拷贝区。2.缺点：①用于二倍体生物时，不能很好的区别杂合子和纯合子②在某种情况下，实验重复性不高，实验结果可靠性低③使用效果受生物种类的影响

如何简单设计一个实验，运用RAPD标记分析植物间的遗传多样性？

六、SSR标记

SSR标记技术实验原理：SSR即简单重复序列，又称微卫星DNA，根据微卫星DNA两端的单拷贝序列设计一堆特异引物，利用PCR技术，扩增每个位点的微卫星序列，通过电泳分析核心序列的长度多态性。一般的，同一类微卫星DNA可分布于整个基因组的不同位置上，而通过其重复的次数不同以及重复程度的不完全而造成每个座位的多态性。SSR标记的多态性丰富，重复性好，其标记呈共显性，且在基因组中分散分布，因此可作为遗传标记。

SSR标记技术的应用：SSR标记技术已被广泛用于遗传图谱构建，品种指纹图谱绘制及品种纯度检测，以及目标性状基因标记等领域。特别在人类和哺乳动物的分子连锁图谱中，微卫星标记已成为取代RFLP标记的第二代分子标记。

SSR标记技术特点：1.优点：①数量丰富，覆盖整个基因组，揭示的多态性高②具有多等位基因的特性，提供的信息量高③以孟德尔方式遗传，呈共显性，可鉴别出杂合子和纯合子④每个位点由设计的引物顺序决定⑤结果重复性高，稳定可靠⑥DNA用量少，对DNA质量要求不高，操作简单⑦SSR标记一般检测到的是一个单一的多等位基因位点⑧SRR序列的两侧序列常较保守，在同种而不同遗传型间多相同⑨需要事先知道重复序列两侧的DNA序列的信息来设计引物，因此引物开发成本高，但一旦开发，同行受益无穷。2.缺点：①开发和合成新的SRR引物投入高、难度大②现有的SSR标记数量有限，不能标记所有的功能基因，不能构建饱和的SRR遗传图谱③SSR多态性的检测和应用很大程度上依赖PCR扩增的效果④SSR座位突变率高，对变异反应非常敏感等。 SSR标记如何设计引物：①建立基因组DNA的质粒文库②根据欲得到的SRR类型设计并合成寡聚核苷酸探针，通过菌落杂交筛选所需重组克隆③对阳性克隆DNA插入序列测序④根据SSR两侧序列设计并合成引物⑤以待研究的植物DNA为模板，用合成的引物进行PCR扩增反应⑥高浓度琼脂糖凝胶，非变性或变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测其多态性。

七、AFLP

AFLP标记技术的原理：AFLP技术是基于PCR反应的一种选择性扩增限制性片段的方法。由于不同物种的基因组DNA大小不同，基因组DNA经限制性内切酶完全消化后，在限制性片段两端连接上人工接头作为扩增

内切酶特定序列和3’端的选择性碱基。

AFLP的应用：①可用于构建分子遗传连锁图谱②可用于构建指纹图谱，进行品种鉴定③可用于种内和种间的遗传多样性研究④可用于分子标记辅助选择育种⑤可用于基因定位基因克隆的研究。

AFLP标记技术特点;1.优点：AFLP不需要预先知道DNA序列的信息，因此可以用于没有任何分子生物学研究基础的物种，概括其特点如下：①用于AFLP分析的限制性内切酶与选择性碱基组合的数目和种类很多②AFLP多态性远远超过其他分子标记③多数表现孟德尔方式遗传④模板用量少，且对模板浓度的变化不敏感⑤AFLP标记中由于扩增片段较短，其分辨率很高⑥由于利用特定引物扩增，退火温度高，因而假阳性低，可靠性高⑦AFLP分析的大多数扩增片段与基因组的单一位置相对应，可用于分析基因组DNA及克隆相应的DNA片段，可作为遗传图谱和物理图谱的位标和联系两者的桥梁。2.缺点：①AFLP标记技术试验中对样品DNA的质量要求较高②内切酶质量要求比较高③技术难度高，成本比较昂贵④很难鉴别等位基因⑤受专利保护，目前用于分析的试剂盒价格昂贵，分析成本高⑥实验中产生的大量谱带，对其分析和解释有时存在困难，需要借助计算机软件的帮助。

DNA甲基化：是由DNA甲基化酶催化的一种天然修饰方式。甲基化是基因组DNA的一种主要的表观遗传修饰方式，是调控基因组功能的重要手段。本质上只影响表型而不影响基因型改变。

RFLP标记：限制性片段长度多态性标记 PCR：聚合酶链式反应

RAPD标记：随机扩增多态性DNA标记 AFLP标记：扩增片段长度多态性标记 SSR标记：简单序列重复标记

几个标记的不同点、相同点（不全） 类别 RFLP RAPD AFLP SSR 检测分子杂交 随机PCR限制性酶切，特异技术 扩增 特异PCR PCR扩增 多态酶切位点扩增出酶切位点碱基复制中性基碱基插入、DNA插插入、缺失、分子滑础 缺失倒位、入、缺失、倒位、突变等 动或不突变 突变等 等交换 多态较高 较高 非常高 高 性水平 结果高 低 高 高 可重复性 遗传共显性 多为共显共显性/显性 多为共方式 性 显性 探针/物种特异9~10bp随由核心序列，特异引引物 性DNA片机引物 酶切位点及选物 段 择性碱基组成的特定引物 检测单低拷贝全基因组 全基因组 重复序基因编码区 列区 区