环境生物技术实验讲义(1)

涡旋振荡器，EP管。 试剂：

1、0.1%磷酸钠缓冲液（PH 8.0）100ml ：1M Na2HPO4 93.2ml、1M NaH2PO4 6.8 ml，加热配制。 2、溶菌酶。

3、20% SDS 100ml：20g SDS 加灭菌水定容至100ml，加热。 4、70%乙醇：70ml无水乙醇，加灭菌水30ml。

5、TE缓冲液（PH 8.0）：1M Tris-cl 500ul， 0.2M EDTA 250ul，灭菌水49250ul 6、异丙醇，

7、8mol/LKAc溶液：392.56g KAC 加灭菌水500ml，121℃灭菌20min。 8、1kb DNA分子量标准。

9、1%琼脂糖：0.5g 琼脂糖加5ml 10×TBE，45ml水。

10、10×TBE： Tris-base 54g、Boric Acid 27.5g、Na2EDTA 4.65g 加蒸馏水定容至500ml，用HCL调PH 8.3 11、核酸上样缓冲液：10×ladder 四、 实验方法： 1、

取1g活性污泥，离心12000rpm 3min 去上清，灭菌水洗涤2次，10000rpm 3min,去上清。加1ml 0.1mol/L PH8磷酸钠缓冲液,漩涡震荡器震荡20min。 2、

加溶菌酶5mg，使终浓度为2.5mg/ml，振荡5min,37℃水浴30min。

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3、 4、

加120ul20%SDS轻柔振荡15min，6000rpm离心10min。 取上清液加0.2倍体积冰冷的8MKAc，颠倒混匀1min，12000rpm离心10min。

5、 吸取上清液移到新的EP管中，加0.6倍体积冰冷的异丙醇，颠倒混匀1min，室温下放置10min，12000rpm离心10min。

6、 去上清，加1ml 70% 乙醇洗涤DNA 沉淀，12000rpm离心2min，去乙醇后于37℃干燥 10min。

7、 8、

重复做第6步

每管加100 ul TE+400ul灭菌水+0.6倍体积冰冷的异丙醇，颠倒混匀，室温静置10min，12000rpm离心10min。

9、 弃上清液，将沉淀定容于200ulTE缓冲液中，加0.2倍体积8M KAC，颠倒混匀，室温静置5min，12000rpm离心10min。

10、 吸取上清液移到新的EP管中，加0.6倍体积冰冷的异丙醇，颠

倒混匀，室温静置10min，12000rpm离心10min。

11、 弃上清液，用1ml 70% 乙醇洗涤DNA 沉淀、12000rpm离心

10min，干燥，溶于200 ul TE缓冲液中。

12、 吸取20ul DNA溶液，在1%琼脂糖凝胶上进行电泳，检测DNA

提取效果。加上1kbMaker作为DNA大小的标准。 五、实验报告

把在1%琼脂糖凝胶观察到的现象记录下来，进行分析。 六、思考题

①SDS和乙酸钾的作用?

6

②不同浓度的琼脂糖凝胶电泳的分辨率?

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实验三 微生物总DNA中的16SrDNA PCR扩增技术

一、 实验目的

①了解以通过引物进行16SrDNA PCR扩增的基本原理

②掌握从活性污泥微生物总DNA中进行16SrDNA PCR扩增的方法 二、 实验原理

RCR是一种选择性体外扩增DNA的方法，类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物PCR由变性—退火—延伸三个基本反应步骤构成。

在本实验中，PCR扩增的模板是从活性污泥中提取的微生物总DNA，扩增的目的序列是微生物16SrDNA的V3区。采用的引物是细菌的一对通用引物，正向引物338F:5’-CGC CCG CCG CGC GCG GCG GGC GGG GCG GGG GCG CGG GGG GAC TCC TAC GGG AGG CAG CAG-3’。反向引物518R：5’-ATT ACC GCG GCT GCT GG-3’。其中，正向引物338F的5’端连接有40bp的GC 发夹，以增加DNA解链区的GC含量，提高解链温度。 三、 实验仪器和试剂 ①样品

从活性污泥中提取得到的微生物总DNA。 ②仪器及相关用品

PCR扩增仪，琼脂糖凝胶电泳所需的设备，凝胶成像分析系统，移液枪及吸头，PCR管，高速离心机。 ③试剂

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