2011DNA-RNA相关整套分子生物学实验方法

冰箱中20分钟，然后4C下12000g离心5分钟。

6． 弃上清液，将管口敞开倒置于卫生纸上，使所有液体流出，加入1ml 70%乙醇液沉

淀一次，4C下12000g离心5~10分钟。

7． 吸除上清液，将管倒置于卫生纸上使液体流尽，真空干燥10分钟或室温干燥。 8． 将沉淀溶于20μl TE缓冲液（pH8.0，含20μg/ml RNaseA）中，储于-20C冰箱中。 【注意】

1． 提取过程尽量保持低温。

2． 采用酚/氯仿去除蛋白效果较单独用酚或氯仿好。

3． 沉淀DNA通常用冰乙醇，低温条件下放置时间稍长可使DNA沉淀完全。

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三、相关试剂配制

（1）溶液I：50mmol/L 葡萄糖溶液

25mmol/L Tris-Cl (pH8.0) 10mmol/L EDTA (pH8.0)

（2）溶液II：0.2mol/L NaOH, 1%SDS （3）溶液III：5mol/L的乙酸钾

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实验四、DNA酶切及鉴定

一、 原理

限制酶主要存在原核细胞中。多数来源于细菌，有的来源于蓝藻和链霉菌，极少数来源于支原体等微生物中，存在原核细胞的限制酶能在特异的识别位点切断外源DNA，如感染的噬菌体。而宿主细胞内的DNA则因它的一些特异识别位点常常由于其中一个碱基的甲基化被保护起来，从而使此位点不再成为限制酶的底物。限制性内切酶能特异地结合的一段DNA序列被称为限制性识别序列，其长度一般为4-6个核苷酸，且呈二重对称，或称之为回文序列。目前许多限制性内切酶的位点已被确定。例如：EcoRI切割位点为： 5’ G A A T T C 5’

3’C T T A A G’5’

二、实验试剂

限制性内切酶：EcoRI、MesI等

三、操作步骤

（一）．DNA酶切反应

（1） 将清洁干燥并经灭菌的eppendorf编号，用微量移液枪分别加入DNA 1μg

和相应的限制性内切酶反应10×缓冲液2 μl，再加入重蒸水使总体积为19 μl，将管内溶液混匀后加入1 μl酶液，用手指轻弹管壁使溶液混匀，也可用微量离心机甩一下，使溶液集中在管底。

（2） 混匀反应体系后，将eppendorf管置于适当的支持物上，37℃水浴保温2～

3小时，使酶切反应完全。

（3） 每管加入2μl 0.1mol/L EDTA（PH8.0），混匀以停止反应(可做可不做)，置

于冰箱中保存备用。

（二）DNA电泳分析

取2μl 以上酶切DNA样品在1%Agarose胶上电泳，检测DNA的分子大小。

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实验五、目的基因的PCR扩增

一、原理

PCR（聚合酶链式反应）是一种选择性体外扩增DNA或RNA的方法。它包括3个基本步骤：⑴ 变性：目的双链DNA片段在94℃下解链； ⑵ 退火：两种寡核苷酸引物在适当温度（50℃左右）下与模板上的目的序列通过氢键配对；⑶ 延伸：在Taq DNA聚合酶合成DNA的最适温度下，以目的DNA为模板进行合成。由这3个基本步骤组成一轮循环，理论上每一轮循环将使目的DNA扩增一倍，这些经合成产生的DNA又可作为下一轮循环的模板，所以经25~35轮循环就可使DNA扩增达10倍。

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二、实验试剂

Taq酶 相应引物 dNTP等

三、操作步骤

（一）PCR反应

1. 所用溶液融化后置于冰上。 2. 依次混匀下列试剂：

25μl 10×PCR buffer 15μl 25mmol/L MgCl2 25μl 4种dNTP 5μl 引物1 5μl 引物2 124μl ddH2O 1μl Taq 酶 混匀后离心5秒种。

3. 分成10管，每管各加5μl模板DNA（约1ng），编号。 4. 混匀后离心5秒种，PCR扩增。 5. 参数设定 T (℃) 94 94 55-60 72 72 4

Duration 2 min 0.5 min 0.5 min 1 min 10 min 2 hr 7

Cycle 1 30 1 storage （二） 电泳

取10μl扩增产物用1%琼脂糖胶进行电泳分析，检查反应产物及长度。 【注意】

1. PCR反应非常灵敏，操作应尽量在无菌操作台中进行。

2. 吸头、离心管应高压灭菌，每次吸头用毕应更换，不要相互污染试剂。

3．试剂前，应短促离心10秒钟，然后再打开管盖，以防手套污染试剂及管壁上的试剂污染吸头侧面。

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