从土壤中分离产淀粉酶的芽孢杆菌实验方案解析

土壤中产淀粉酶芽胞杆菌的筛选及其淀粉酶活力的测定设计性实验方案 一、综述：

淀粉酶是淀粉降解酶。它们广泛存在于微生物、植物和动物体中。它们将淀粉及相关的聚合物分解为带有具体淀粉分解酶特征的产品。淀粉酶广泛存在于动植物和微生物中,是最早用于工业生产并且迄今仍是用途最广、产量最大的酶制剂产品之一。淀粉酶种类繁多,特点各异,可应用于造纸、印染、酿造、果汁和食品加工、医药、洗涤剂、工业副产品及废料的处理、青贮饲料及微生态制剂]等多种领域。在酿造发酵工业如酒精生产、啤酒制造、发酵原料液化及糖化工艺过程中均有重要价值,如添加淀粉酶分布非常广泛，是人们经常研

【】究的一种酶。从纺织工业到废水处理，这些酶都有不同规模的应用1。 常见产淀粉酶的主要为芽孢杆菌属。其中的常见产淀粉酶的芽孢杆菌菌种有：地衣芽

【】【】孢杆菌、枯草芽孢杆菌、蜡样芽孢杆菌和纳豆芽孢杆菌2、凝结芽孢3。由于芽孢杆菌属

是一类好氧或兼性厌氧、产生抗逆性内生抱子的杆状细菌，许多为腐生菌，主要分布于土壤【】和植物体表面及水体中4。所以此次实验从土壤中分离产淀粉酶的芽孢杆菌。

二、实验目的要求

1．了解生物分离提纯的原理和方法技术

2．掌握从土壤中筛选产淀粉酶菌株的原理和方法

3.掌握微生物摇瓶培养方法及淀粉酶活力测定的原理和方法 4.培养学生的综合应用微生物实验方法的能力

5.培养学生自行设计实验流程、综合分析问题解决问题和判断实验结果的能力。 三、实验原理

自然界中，土壤是微生物生活最适宜的环境。土壤具有微生物进行生长繁殖和生命活 动中所需的各种条件。

土壤中微生物的数量因土壤类型、季节、土层深度与层次等不同而异。一般地说，在土壤表面，由于日光照射及干燥等因素的影响，微生物不易生存，离地表10 cm～30 cm的

【】土层中菌数最多，随土层加深，菌的数量减少5。

从混杂微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程称为微生物分离与纯化。平板分离法普遍用于微生物的分离与纯化。其基本原理是选择适合与待分离微生物的生长条件，如营养成分、酸碱度、温度和氧等要求，或加入某种抑制剂造成只利于该微生物生长，而抑制其他微生物生长的环境，从而淘汰一些不需要的微生物。

值得指出的是，从微生物群体中经分离生长在平板上的单个菌落并不一定保证是纯培养。因此，纯培养的确定除观察其菌落特征外，还要结合显微镜检测个体形态特征后才能确定，有些微生物的纯培养要经过一系列分离与纯化过程和多种特征鉴定才能得到。 芽孢杆菌属的共同特征是：革兰氏阳性；接触酶阳性；水解淀粉；VP试验阳性；不产生吲哚；苯甲氨酸不脱氨；分解酪素；不分解酪氨酸；不产生二羟丙酮；营养体的最高生长温度大约从25℃到75℃以上；最低生长温度大约5℃到45℃；生长最低pH值，从7.5—8到2左右；耐盐范围从低于2%的NaCl到25%NaCl；营养明胶（22℃）7天内液化1厘米或1厘米以上。枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌在糖发酵试验用阿拉伯糖，木糖和甘露糖代

替葡萄糖可产酸；作为营养生长的最低限培养基是无维生素的，但含有葡萄糖、柠檬酸盐和

【】。一个氨态盐作为唯一的碳源和氮源6

四、实验材料和用具 4.1 土样采集：采集广大植物园内的有机土壤，和文科楼旁边的桑园内的土壤，以及郭培国老师的种植园内的土壤、演艺中心旁的土壤。 4.2 营养琼脂(%)：蛋白胨1 牛肉膏0.3 氯化钠0.5 琼脂1.5 ～2.0 蒸馏水 将除琼脂以外的各成分溶解于蒸馏水内，加入15%氢氧化钠溶液约2mL，校正pH至7.2～

7.4。加入琼脂,加热煮沸，使琼脂溶化。

4.3 淀粉牛肉膏蛋白胨培养基(%)：可溶性淀粉0.2 牛肉0.3 蛋白1.0 氯化钠0.5 琼脂1.5～2.0 校正pH至7.2～7.4

4.4 发酵培养基(%)：玉米粉 2 黄豆饼粉 1.5 CaCl 0.02 MgSO4 0.02 NaCl 0.25 K2HPO4 0.2 柠檬酸钠 0.2 硫酸氨0.075(溶解后加) Na2HPO40.2 校正pH值7.0 4.5 葡萄糖蛋白胨培养基（V.P试验用）（%）：葡萄糖0.5 蛋白胨0.5 K2HPO4 0.2 校正pH 7.2～7.4

4.6 蛋白胨水培养基（吲哚试验用）（%）：蛋白胨1% 氯化钠0.5% 校正pH 7.2～

7.4

4.7 西蒙氏柠檬酸盐培养基（%）：氯化钠0.5 硫酸镁(MgSO4·7H2O)0.02 磷酸二氢铵0.1 磷酸氢二钾0.1 柠檬酸0.5 琼脂2 溴麝香草酚蓝溶液4 酚红试剂 校正pH6.8

先将盐类溶解于水中，校正pH，再加入琼脂，加热融化，然后加入指示剂，混匀后分装试管，121℃高温灭菌15min。

4.8 配制营养明胶培养基（%）：蛋白胨 0.5、牛肉膏0.3、明胶1.2，调pH 6.8~7.0

4.9耐盐培养基（%）： ①蛋白胨1 牛肉膏0.3 氯化钠2 琼脂1.5 ～2.0 蒸馏水 ②蛋白胨1 牛肉膏0.3 氯化钠10 琼脂1.5 ～2.0 蒸馏水

③蛋白胨1 牛肉膏0.3 氯化钠20 琼脂1.5 ～2.0 蒸馏水 ④蛋白胨1 牛肉膏0.3 氯化钠25 琼脂1.5 ～2.0 蒸馏水

加入15%氢氧化钠溶液约2mL，校正pH至7.2～7.4。加入琼脂,加热煮沸，使琼脂溶化。

4.10 溶液或试剂染料

革兰氏染色：草酸铵结晶紫染色液、卢戈氏碘液、95%乙醇; 芽孢染色：5%孔雀绿溶液, 石炭酸复红液; 香柏油、二甲苯 吲哚试验：乙醚、吲哚试剂

V.P.试验：40％NaOH溶液、α-奈酚，

淀粉酶活力测定：1%3, 5- 二硝基水杨酸试剂 4.11 仪器或其它用具

无菌玻璃涂棒 无菌吸管 接种环 无菌培养皿 土样 三角瓶 烧杯 洗瓶 玻棒 试管 酒精灯 擦镜纸 接种环 酒精灯 载玻片 吸水纸等。

恒温摇床 恒温培养箱 高压蒸汽灭菌箱 超净工作台 水浴箱 紫外灯照射箱 磁力搅拌器 玻璃珠 移液管 涂布器 显微镜 五、实验方法及步骤 1、初筛方法

①制菌悬液：五个土样分别取5g，放入各自装有45mL无菌水的三角瓶，振荡10min,即为稀释10-1的土壤悬浮液。每个环境的土样装1个锥形瓶，共5个，同时将其分为10组，编号ABCDE。

②加热筛选有芽孢的菌：将5个锥形瓶加塞、包扎、摇匀（无菌室里），利用恒温水浴装置制悬液时就应先开始加热），制成10-1 g/ml的土壤悬液

③梯度稀释菌悬液：再分别另取装有9mL无菌水试管5支，用记号笔编上10-2、10-3、10-4、

10-5。取已稀释成10-1土壤液，振荡后静止0.5min，用无菌的移液器吸取1mL土壤悬液加入10-2的无菌水的试管中，并在试管内轻轻反复吹吸数次，使之充分混匀，即成10-2土壤稀释液。同法从10-2的试管中吸取1mL稀释液加入编号为10-3的无菌水试管中，混匀后即为10-3土壤稀释液，依次连续稀释为10-4、10-5土壤稀释液。

在土壤稀释过程中，用相同的移液枪头由浓到稀来稀释。

④涂布平板 用一支新的无菌枪头，由低浓度开始，从各浓度土壤稀释液中各吸取100ul，对号较均匀地放入已写好稀释度的牛肉膏蛋白胨培养基平板上，用灼烧冷

却后的无菌玻璃涂棒涂匀。每个浓度做3个平板（重复）。37℃下恒温培养24h。

2、复筛方法【1】

划线接种（分区划线法）：在上述不同稀释度培养基中挑取不同形态的 单菌落进行分区划线，先在平板培养基的一边作第1次平行划线3~4条， 再转动培养皿约60°角，并将接种环上剩余物烧掉，待冷却后通过第1 次划线部分作第2次平行划线，再用同法通过第2次平行划线部分作第 3次平行划线和通过第3次平行划线部分作第4次平行划线（如右图）。 划线完毕，盖上皿盖，倒置于28~29°C温室中培养约20h.。再继续分 区划线2-3次，以获得较纯的菌种。

将纯化得到的单菌落分为两部分，其中一部分接种到培养基内， 用以保存菌种，另一部分用来做染色实验。 3、获得产淀粉酶芽孢杆菌纯种：

上述划线接种后的菌落中各挑取形态特征不一致的点接于倒好的淀粉牛肉膏培养基中，一个土样取8个平板两两标记同一位置同序号标记，一平板分5个区域，点接重复两次，在37℃培养箱中培养24h。

上述点接后的平板中取出一组四个分好区域的淀粉牛肉膏培养基平板于实验室，其他置于无菌室。实验室里，四个平板均加入碘液，立即观察记录阳性和阴性菌落所在位置，并可同时记录透明圈的大小。根据所记录的阳性菌的编号，利用另一组中的营养琼脂平板上其对应的菌落继续划线接种，培养后将出现的形态特征不一致的菌落进行编号，然后挑取部分出来进行革兰氏染色镜检，若发现视野内出现形态、大小、颜色一致且为杆菌的菌体，则将其对应的菌种划线接种到新的营养琼脂平板上，标记，37℃下培养24h。否则继续进行划线分离，培养后再经革兰氏染色镜检直至得到纯种杆菌后进行芽孢染色。筛选出芽孢纯种后进行斜面接种。

革兰氏染色步骤：