分子生物学研究法-基因功能研究技术 - 图文

敲除小鼠，实验证明，纯合小鼠体内检测不到IAP蛋白，而该基因的敲除导致小鼠变胖（图6-15）。在条件型基因敲除实验中，首先构建带有S6基因的LoxP打靶载体的ES细胞，经过杂交筛选，获得纯合体小鼠；再与带有肝组织特异性、受INF-α诱导的Mx-Cre转基因小鼠杂交，删除neo和外显子3-5，得到肝组织特异性敲除S6基因小鼠后发现，［3H］胸腺嘧啶不能掺入S6基因敲除小鼠肝组织，细胞不能进入S期，不能正常分裂增殖（图6-16）。

一般来说，动物基因敲除时用显微注射胚胎干细胞命中率较高，技术难度相对大些。电穿孔法命中率比显微注射低，但操作相对简单易行。

因为同源重组常常发生在某一条染色体上,要得到稳定遗传的纯合体基因敲除模型，至少需要两代以上的遗传。除了基因敲除法，还有人用基因捕获的方法通过随机插入突变破坏靶基因表达（图6-17）。基因捕获载体包括一个无启动子的报告基因（通常为neor基因），当该基因插入到ES细胞染色体某个部位，利用所在位点的转录调控元件得到表达时，该ES细胞就获得在含G418的选择性培养基上生长的能力。可通过分析标记基因侧翼cDNA或染色体DNA序列来获得靶基因的相关信息。

由于受整合位点附近染色质区的影响，转基因整合具有显著的位置效应，基因5’端启动子和增强子区，3’端终止子区都会对转基因的整合产生影响，这是某些打靶载体选择组织特异性启动子的原因之一。外源转基因的有效表达有时还取决于其是否有内含子，因为内含子中存在的转录调控元件可影响mRNA的剪切以及启动子与内含子间的相互作用。另外，内含子可能含有能开放染色体功能域的序列，还可能通过影响核质成分、位置等来影响基因表达强度。

除了研究基因功能之外，基因敲除技术还被广泛应用于建立人类疾病的转基因动物模型，为医学研究提供遗传学数据，为遗传病的治疗、为生物新品种的培育奠定新基础。

6. 2. 3 植物基因敲除技术

由于动植物细胞结构显著不相同，植物细胞基因敲除常采用不同于动物细胞的策略。T-DNA插入失活技术是目前在植物中使用最为广泛的基因敲除手段。T-DNA

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插入失活就是利用根瘤农杆菌T-DNA介导转化，将一段带有报告基因的DNA序列标签整合到基因组DNA上，如果这段DNA插入到目的基因内部或附近，就会影响该基因的表达，从而使该基因“失活”。由于该基因内部或附近插入了一段已知序列的DNA，可据此设计引物，用PCR方法将被破坏的靶基因序列分离出来（图6-18A）。若将靶基因（假定编码区为900个碱基对）两端的引物LP、RP及插入载体上的引物LB加入同一反应体系中进行PCR，理论上能得到三种类型的条带（图6-18B）。野生型植株中，只有LP和RP引物配对扩增出来的靶基因条带；如果实验材料来自纯合型基因敲除植株，那么，只有靶基因一端的引物可以与LB引物配对完成PCR扩增；如果实验材料来自杂合型基因敲除植株，那么，PCR扩增后会同时出现两种条带。

T-DNA无专一整合位点，在植物基因组中发生随机整合，所以，只要突变株的数目足够大，从理论上就可能获得任何一个功能基因都发生突变的基因敲除植物库。拟南芥基因组冗余序列少，基因密度高，几乎每一个DNA插入都会导致某个基因功能的丧失，结合已完成的拟南芥基因组信息，人们很容易筛选到新的功能基因。已经用T-DNA插入失活方法建立了拟南芥大规模基因敲除突变体库，研究人员可以方便地在多个数据库中检索到感兴趣基因的突变体，再开展深入的表型分析和功能研究。

6. 3 蛋白质及RNA相互作用技术 6. 3. 1 酵母单杂交系统

酵母单杂交系统（yeast one-hybrid system）是上个世纪90年代中期发展起来的新技术，可识别稳定结合于DNA上的蛋白质，可在酵母细胞内研究真核生物中DNA-蛋白质之间的相互作用，并通过筛选DNA文库直接获得靶序列相互作用蛋白的编码基因。此外，该体系也是分析鉴定细胞中转录调控因子与顺式作用元件相互作用的有效方法。

酵母单杂交的基本原理如图6-19所示，首先将已知的特定顺式作用元件构建到最基本启动子（minimal promoter，Pmin）的上游，把报告基因连接到Pmin下游。然后，将编码待测转录因子cDNA与已知酵母转录激活结构域（transcription

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activation domain, AD）融合表达载体导入酵母细胞，该基因产物如果能够与顺式作用元件相结合，就能激活Pmin启动子，使报告基因得到表达。

目前，酵母单杂交体系主要被用于确定某个DNA分子与某个蛋白质之间是否存在相互作用，用于分离编码结合于特定顺式调控元件或其他DNA位点的功能蛋白编码基因，验证反式转录调控因子的DNA结合结构域，准确定位参与特定蛋白质结合的核苷酸序列。由于该方法的敏感性和可靠性，现已被广泛用于克隆细胞中含量极低且用生化手段难以纯化的那部分转录调控因子。常用的酵母单杂交体系基本选用HIS3或LacZ作为报告基因，虽然有的体系将带有报告基因的载体直接整合于酵母染色体上，在大部分的实验中报告基因都位于质粒DNA上。图6-20是利用酵母单杂交体系和已知的顺式作用元件DRE从拟南芥cDNA文库中筛选转录调控因子的基本流程。实验中如果将不同的未知基因与酵母GAL4的DNA结合结构域相融合，通过检测位于GAL4顺式作用元件下游的报告基因的表达状况，还可以鉴定出该转录因子是否具有转录激活功能。

6. 3. 2 酵母双杂交系统（Yeast two-hybrid system）

该体系巧妙地利用真核生物转录调控因子的组件式结构（modular）特征，因为这些蛋白往往由两个或两个以上相互独立的结构域构成，其中DNA结合结构域（binding domain，BD）和转录激活结构域AD是转录激活因子发挥功能所必须的。单独的BD能与特定基因的启动区结合，但不能激活基因的转录，而由不同转录调控因子的BD和AD所形成的杂合蛋白却能行使激活转录的功能。实验中，首先运用基因重组技术把编码已知蛋白的DNA序列连接到带有酵母转录调控因子（常为GAL1、GAL4或GCN1）DNA结合结构域编码区（BD）的表达载体上。导入酵母细胞中使之表达带有DNA结合结构域的杂合蛋白，与报告基因上游的启动调控区相结合，准备作为“诱饵”捕获与已知蛋白相互作用的基因产物。此时，若将已知的编码转录激活结构域（AD）的DNA分别与待筛选的cDNA文库中不同插入片段相连接，获得“猎物”载体，转化含有“诱饵”的酵母细胞。一旦酵母细胞中表达的“诱饵”蛋白与“猎物”载体中表达的某个蛋白质发生相互作用，不同转录调控因子的AD和BD结构域就会被牵引靠拢，激活报告基因表达。分离有报告

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基因活性的酵母细胞，得到所需要的“猎物”载体，就能得到与已知蛋白相互作用的新基因（图6-21）。

6. 3. 3 蛋白质相互作用技术

1、等离子表面共振技术

该技术是将诱饵蛋白结合于葡聚糖表面，将葡聚糖层固定于纳米级厚度的金属膜表面。当有蛋白质混合物经过时，如果有蛋白质同“诱饵”蛋白发生相互作用，那么两者的结合将使金属膜表面的折射率上升，从而导致共振角度的改变。而共振角度的改变与该处的蛋白质浓度成线性关系，由此可以检测蛋白质之间的相互作用（图6-22）。该技术不需要标记物和染料，安全灵敏快速，还可定量分析。缺点是需要专门的等离子表面共振检测仪器。

图6-23应用SPR技术研究COI1蛋白与JAZ1蛋白之间的相互作用。研究人员首先在葡聚糖芯片表面固定1000共振单位的茉莉酸（JA）信号通路负调控因子JAZ1蛋白，当体系中同时有茉莉酸－异亮氨酸（JA-Ile）及COI蛋白存在时，可以检测到最高达380共振单位的SPR反应信号。加入一种在结构和功能上与茉莉酸甲脂（MeJA）非常相似的名为冠毒素(COR)的细菌毒素，也能使COI1和JAZ1发生相互作用。

2、免疫共沉淀技术(Co-Immuno Precipitation，CoIP)

该技术的核心是通过抗体来特异性识别候选蛋白。首先，将靶蛋白的抗体通过亲和反应连接到固体基质上，再将可能与靶蛋白发生相互作用的待筛选蛋白加入反应体系中，用低离心力沉淀或微膜过滤法在固体基质和抗体的共同作用下将蛋白复合物沉淀到试管的底部或微膜上。如果靶蛋白质与待筛选蛋白发生了相互作用，那么，这个待筛选蛋白质就通过靶蛋白与抗体和固体基质相互作用而被分离出来（图6-24）。

免疫共沉淀实验中常用pGADT7和pGBKT7质粒载体分别以融合蛋白形式表达靶蛋白，体外转录、翻译后将产物混合温育，分别用Myc或HA抗体沉淀混合物，过柱后再用SDS－PAGE电泳分离，检测两个靶蛋白之间是否存在相互作用

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