发酵工艺学原理思考题参考答案

肟酸盐抗性突变株 LysHxr（4）苏氨酸氧肟酸盐抗性突变株 ThrHxr

使用黄色短杆菌进行赖氨酸的发酵，还可以选育具有双重标记的营养缺陷型突变株（Met- + Thr-）,其本质上和Hos- 是一样的，但双重标记的营养缺陷型突变株的优点是：遗传性质稳定，恢复突变的几率少。

9.简述磷酸盐在抗生素发酵过程中的调节作用。

磷酸盐对抗生素发酵的影响具有双重性，主要表现在：

（1）高浓度的磷酸盐对抗生素的生物合成具有抑制和阻遏作用

①抑制或阻遏抗生素合成途经中的某些关键酶。已有许多研究证明：当磷酸盐的浓度≧10mmol/L时，菌体内与抗生素合成有关的酶的活性将受到抑制。 ②高浓度的磷酸盐可以改变菌体的代谢途径。

高浓度的磷酸盐改变MEP，HMP，不利于HMP的进行，当然也不利于以HMP途经中的中间产为前提的次级代谢产物的生物合成。

（2）磷酸盐浓度低时，菌体生长速度缓慢，生长量（菌体浓度）也不够，不利于抗生素的生物合成。

10.说明微生物细胞内NH+4参与分解与合成代谢的途径。

在抗生物的发酵过程中，培养基中如果存在容易被利用的无机氨态氮，例如：（NH4）2SO4、NH4CL等，或其他可以被迅速利用的氮源，则对抗生素的合成有强烈的抑制作用。

4+

NH可以强烈的刺激菌体的生长，进而影响了菌体从生长型到产物积累性的转变，影响了抗生素的生物合成。发酵中期当微生物群体进入产物合成期时，如果向发酵液中流加氮源，则可以造成 发酵逆转 ，使微生物群体返回到生长期而停止产物的合成

11.写出谷氨酸发酵的最理想途径，说明CO2固定化反应的重要性。 Glucose EMP 丙酮酸 + 丙酮酸

CO2 CO2 草酰乙酸

（草酰乙酸 羧化酶）

乙酰辅酶A + C4二羧酸

苹果酸

（苹果酸激酶）

柠檬酸（DCA循环封闭）

谷氨酸

体系不存在CO2固定反应：

3/2 C6H12O6 + NH4+ == C5H9O4 + 4 CO2 产率：147 /（180*3/2） == 54.4% 体系存在CO2固定反应：

C6H12O6 + NH4+ == C5H9O4 + CO2 产率：147 / 180 == 81.7%

可见，在GA的生物合成过程中，CO2固定反应对于产率的提高有着多么重要的作用。

12.谷氨酸产生菌之所以能够合成、积累并分泌大量的GA，其菌种内在的原因有哪些？

1.α—KGA脱氢酶酶活性微弱或丧失 这是菌体生成并积累α—KGA的关键，从上图可以看出，α—KGA是菌体进行TCA循环的中间性产物，很快在α—KGA脱氢酶的作用下氧化脱羧生成琥珀酸辅酶A，在正常的微生物体内他的浓度很低，也就是说，由α—KGA进行还原氨基化生成GA的可能性很少。只有当体内α—KGA脱氢酶活性很低时，TCA循环才能够停止，α—KGA才得以积累。

2.GA产生菌体内的NADPH的在氧化能力欠缺或丧失（1）如上图所示，NADPH是α—KGA还原氨基化生成GA必须物质，而且该还原氨基化所需要的NADPH是与柠檬酸氧化脱羧相偶联 的。（2）由于NADPH的在氧化能力欠缺或丧失，使得体内的NADPH有一定的积累，NADPH对于抑制α—KGA的脱羧氧化有一定的意义。

3.产生菌体内必须有乙醛酸循环（DCA）的关键酶——异柠檬酸裂解酶。该酶是一种调节酶，或称为别构酶，其活性可以通过某种方式进行调节，通过该酶酶活性的调节来实现DCA循环的封闭，DCA 循环的封闭是实现GA 发酵的首要条件。

4+

4.菌体有强烈的L—谷氨酸脱氢酶活性α—KGA + NH +NADPH == GA + NADP L—谷氨酸脱氢酶，实质上GA产生菌体内该酶的酶活性都很强，该反应的关键是与异柠檬酸脱羧氧化相偶联

13.谷氨酸产生菌之所以能够在10%以上的葡萄糖培养基上，生产大量的GA,除了上述谷氨酸产生菌的内在本质外，其需要的外在条件有什么？

1.供氧浓度 过量：NADPH的再氧化能力会加强，使α—KGA的还原氨基化受到影响，不利于GA 的生成。 供氧不足：积累大量的乳酸，使发酵液的pH值下降，不利于GA的产生，同时，一部分葡萄糖转成了乳酸，影响了糖酸转化率，降低了产物的提出率。

4+

2. NH浓度（1）影响到发酵液的pH值（2）与产物的形成有关：过低，不利于α—KGA的还原氨基化 过高，产生固安酰胺 NH4+的供给方式：（1）液氨 （2）流加尿素 3.磷酸盐过量：（1）促进EMP途径，打破EMP与TCA之间的平衡，积累丙酮酸，产生乳酸等 （2）产生并积累Val。Val①可以抑制葡萄糖 丙酮酸，使GA的生物合成受到阻止②消耗了丙酮酸，降低了糖酸转化率③发酵液中的Val存在，严重的影响GA 的结晶、提出。

14.谷氨酸发酵过程中，生物素（VH）作用表现在那几个方面？

1.生物素对糖代谢的影响

①生物素对于糖酵解有促进作用，对丙酮酸的有氧氧化——乙酰辅酶A的生成 也有促进作用，但两者的促进作用不一样，对前者大一些，这样培养基中如果有较丰富的VH，就会打破糖酵解与丙酮酸氧化之间的平衡，导致丙酮酸的积累，丙酮酸积累则可能导致乳酸的形成，乳酸声称，则使得碳源利用率降低，而且带来的是发酵液的pH值下降。 ②可以通过控制生物素的浓度，以实现对于乙醛酸循环的封闭。 2.生物素对氮代谢的影响

当VH缺乏时，异柠檬酸裂解酶的活性减弱，那么相反，当VH丰富时，异柠檬酸裂解酶的活性必然加强，则DCA 循环正常进行，DCA循环的进行，一方面提供了大量的“中间性产物”，另一方面，菌体的能和水平得到提高。前者是菌体增殖的物质基础，后者则是菌体增殖的能量的保证。这样的结果是，有利于菌体的增殖和生长，则GA的生物合成就会受到影响，甚至停止，这在生产上，就是通常我们说的“只长菌，不产酸”的现象。

以上分析说明，GA发酵过程中，前期，菌体的增殖期，一定的量的生物素是菌体增殖所必需的；而在产物合成期，则要限制生物素的浓度，以保证产物的正常合成。

3. 生物素对菌体细胞膜通透性的影响

细胞膜通透性的调节对于GA 发酵时非常重要的，正如前述，当菌体进入产物合成期时，开始有GA的产生，这是如果能够大量的把产物及时的排泄到细胞膜外，可以解除GA对L—谷氨酸脱氢酶活性的抑制作用，从而使现由Glucose到GA的高效率转化

生物素对细胞膜合成的影响主要是通过对细胞膜的主要成分——磷脂中的脂肪酸的生物合成来实现的，当限制了菌体脂肪酸的合成时，细胞就会形成一个细胞膜不完整的菌体。其中，将乙酰辅酶A羧化生成丙二酰辅酶A的酶是乙酰辅酶A羧化酶，该酶的辅酶是VH，VH在此反应过程中起到传递CO2的作用。当培养基中VH的浓度较低时，细胞膜的合成就会受影响。

15.生物素（VH）如何封闭乙醛酸循环的？

DCA循环的关键酶是异柠檬酸裂解酶，研究表明，该酶受以下几个因素的影响：① 为醋酸诱导②受琥珀酸的阻遏，其活性受琥珀酸的抑制 这样，当VH缺乏时：（1）丙酮酸的有氧氧化就会减弱(由于VH对TCA循环的促进作用)，则：乙酰辅酶A的生成量就会少，醋酸浓度降低，它的诱导作用降低；（2）VH对TCA循环的促进作用的降低，使得其中间产物琥珀酸的氧化速度降低，其浓度得到积累，这样它的阻遏和抑制作用加强；两者综合的作用使得，异柠檬酸裂解酶的活性丧失，DCA循环得到封闭。

16.微生物群体当实现从生长型到产物积累性的转变后，从外观上通常会有哪些变化？这些变化的本质是由什么引起的？

庆大霉素的发酵（放线菌）在菌体的增殖期，菌丝体细长，而进入庆大霉素的合成期，菌丝体变得粗短；地衣芽孢杆菌由原来生长期的粗短型转变成细长。这与同样是细菌发酵的谷氨酸发酵不同，后者当菌体从生长型转变成产物积累型后，其形态由细长变为粗短。

外观：菌体停止生长但形态发生变化，变大OD值变大。 本质：某些营养成分成为限制性因子

17.从能荷的角度解释柠檬酸发酵过程中，“只长菌，不产酸”的原因。

菌体要大量合成柠檬酸，从葡萄糖经过EMP到柠檬酸整个代谢途径需要畅通，在这个过程中，有一步反应：丙酮酸氧化脱羧，每分子丙酮酸可产生一分子的NADH，在有氧的条件下，每分子的NADH经过呼吸链彻底氧化成H2O，并氧化磷酸化产生3分子的ATP，造成了微生物体内能荷的增加，能荷增加则抑制PFK等关键酶的酶活性，使得从葡萄糖到柠檬酸的代谢停止。如果NADH（还原型）不能够快速的被氧化转变成NAD（氧化型），则整个反应就会因为缺乏作为推动力的氧化型的NAD而停止，仍然不能够合成柠檬酸。而实际上，柠檬酸产生菌可以在有氧的条件下大量生成柠檬酸，即NADH即被氧化了，又没有产生ATP。该菌体内存在一条侧系呼吸链，NAD(P)H经过该呼吸链，可以正常的传递H+，将其氧化为H2O，但是并没有氧化磷酸化生成ATP，该侧系呼吸链中的酶系强烈需氧，如果在柠檬酸的发酵过程中，发酵液的溶氧浓度在很低的水平维持一段时间，或者在这期间中断供氧一段时间（20分钟，根据处理情况如：紧急保压等）则这一侧系呼吸链不可逆的失活，其结果是菌体不再产酸，而是产生了大量的菌体，因为，标准呼吸链的存在使得菌体在代谢过程中产生了大量的ATP，用于菌体自身的生长上，这种现象，在生产上通常称之为：只长菌不产酸 。

第五章

1.基本概念 发酵热：发酵过程中，由于菌体对培养基利用而发生的生物反应及搅拌时产生的摩擦等等，

都会产生一定的热量。同时罐壁的散热、水分的蒸发等也带走了一部分热量，发酵过程中释放出来的净热量称为发酵热Q发酵热 = Q生物热 + Q搅拌热 + Q蒸发热 + Q辐谢热

生物热：微生物在生长过程中，由于培养基中的营养性物质：糖、蛋白质、脂肪等被氧化，

同时产生大量的热量，这些热量一部分用于合成高能物质（ATP\\GTP）等，这些高能物质用于菌体自身的生长、繁殖上；剩余的另一部分，则以热的形式散发出来，其表现在外观上，就是使培养基的温度升高，这一部分热量称之为生物热

发酵动力学类型：发酵过程中菌体生长与碳源消耗及产物合成之间不同的动力学关系，分为生长偶联型、部分生长偶联型和非生长偶联型发酵

生长相关型发酵：产物生成速率与细胞生长速率有紧密联系，合成的产物通常是分解代谢的直接产物

混合生长相关型发酵：生长与产物生成相关(如乳酸、柠檬酸、谷氨酸等的发酵)。

非生长相关型发酵：在生长和产物无关联的发酵模式中，细胞生长时，无产物，但细胞停止生长后，则有大量产物积累，产物的形成速率只与细胞积累量有关。

微生物的比生长速率：以单位细胞浓度为基准的细胞生长速率。μ=r/c r：细胞生长

绝对速率 c：细胞浓度

搅拌轴功率：搅拌器输入搅拌流体的功率，即用以克服流体阻力所需用的功率。

氧传递动力学方程：dc/dt = kLa×(c* - c) 也可以写成以（P*-P）为推动力的氧传递方程

式：dc/dt = kLa×（P*-P）

式中：dc/dt——溶氧速率，mol/m3.h kLa——体积溶氧系数，1/h c*——与气相中氧的分压呈平衡的液相中的氧的浓度，也就是一定体系下的液相中的最大的溶氧浓度，mol/ m3 c——液相中氧的实际浓度，mol/ m3

氧传递的双膜理论：○1溶氧过程存在一个界面，这个界面的厚度可以忽略不计。在这个

界面上，气相中氧的分压与溶于液相中氧的浓度呈平衡关系，既Pi与Ci呈平衡关系，符合亨利定律：Ci= K *Pi ②传质过程是一个稳定的过程，各点氧的浓度不是时间的函数。 ○3气膜、液膜都以层流状态存在。

泡沫：定义：泡沫是指气体分散在少量液体中的一种体系。在这个体系中，分散相是气体 连

续相是液体。

化学消泡：向发酵液中流加一定量的消泡剂，利用消泡剂的特殊性质消除掉泡沫的方法 机械消泡：一种物理消泡方法，靠机械强烈震动，压力的变化促使气泡破裂或借机械力将

排出气体中的液体加以分离回收。

2.计算酵母菌在厌氧条件下代谢葡萄糖的发酵热？计算在好氧条件下的发酵热？两者比较说明什么？

（1）酵母菌在有氧条件下生长的生物热

在有氧的的条件下Glucose经过MEP途经生成丙酮酸，丙酮酸进TCA循环被氧化成CO2和H2O，并有38分子的ATP生成，总反应式如下：

C6H12O6 + 38ADP + 38Pi = 38ATP + 6H2O + 6CO2 + Q生物热

-10×38×4.18KJ/mol

这一部分的能量用于菌体生长代谢，即△G= -10×38×4.18KJ/mol