发酵工艺学原理思考题参考答案

次级代谢：是指微生物在生长后期进行的与他们的生长无明显关系的代谢，这一类的物质统称之为：次级代谢产物。例如：抗生素、激素、某些酶制剂等。

分叉中间体：处于代谢的分叉点上的物质，既可以合成初级代谢产物，又可用来合成次级代谢产物。

发酵逆转：在正常的发酵过程中，微生物群体从完成了生长型到产物积累型的转变后，大量的产物开始生成，底物源源不断地转化成产物，但是当培养基中存在易引起分解代谢阻遏的物质时，菌体可能出现二次生长，微生物群体又回到了生长状态，称为发酵逆转。

反馈抑制：是指最终产物抑制作用，即在合成过程中有生物合成途径的终点产物对该途径的酶的活性调节，所引起的抑制作用。

阻遏：指基因的表达在信使RNA合成（转录）阶段为特异的调节因子（阻遏物）所抑制。是指使细胞内特定的酶或酶系合成率降低的现象。 优先合成机制：某种特定的产物优先合成

同功酶：催化同一反应，但其活性受不同代谢产物体调节的酶。

协同反馈抑制：就是该酶有多个活性中心，抑制物可以分别和某一个特定的活性中心结合，但是并不影响该酶的活性，只有当该酶的所有的活性中心都被抑制物结合后，其活性才受到抑制。

营养缺陷型：某些菌株发生突变后，失去合成某些对该在菌株生长必不可少的物质的能力，必须从外界环境获得该物质才能生长繁殖，这种突变型菌株称为营养缺陷型。 抗性突变株：是指野生型菌株因发生基因突变，而产生的对某化学药物或致死物理因子的抗性变异类型。 分解代谢阻遏：当培养基中同时存在多种可供利用的底物时，分解利用某些底物的酶往往被最容易利用的底物所阻遏。

代谢控制发酵：是指利用生物的、物理的、化学的方法，人为的改变了微生物的生长代谢途径，使之合成、积累、分泌我们所需要的产品的过程。

R——调节基因：能产生阻抑物的基因，通过阻抑物与操纵基因的结合与否来控制操纵基因 的关闭和开启。

P---启动子： 有与RNA聚合酶结合的位点，可识别转录起始点的核苷酸序列。 O---操纵基因：对结构基因起着“开关”的作用的核苷酸序列，可直接控制结构基因的转录。 S---结构基因：直接编码乳糖分解代谢所需酶类的基因

2.厌氧甘油发酵和好氧甘油发酵的优缺点比较。 甘油厌氧发酵的缺点：

a.菌体死亡率较高，碱性条件；无能量产生；

b.转化率较低，按照上述能量平衡计算，糖与甘油的转化率不可能超过50%，加上酵母增殖需要消耗一部分糖，发酵液中残留一部分糖，实际转化率远低于50%。这一转化率，导致了厌氧发酵生产甘油的成本较高。 好氧发酵：

优点：在适当（或者说有限的好氧）好氧的条件下，酵母细胞进行有限的好氧呼吸，糖酵解产生的丙酮酸可以通过TCA循环来增加其产能水平，一方面减少3—磷酸甘油醛向乙醛方向进行，增加底物向产物转化的比例；另一方面，增加了细胞能量水平，减少了细胞的死亡率，有利于提高发酵的速率，缩短发酵周期。 缺点：这种有限的好氧发酵，使得丙酮酸进行TCA循环的同时，也增加了TCA循环过程中的许多中间性产物的产生，这对于甘油的提取带来了不利的影响

3.柠檬酸发酵过程中有哪几个控制要点，如何控制？ C6H12O6

（1）点：EMP畅通无阻①控制Mn+ NH4+浓度，解除柠檬酸

读对PFK的抑制 ②控制溶氧，防止侧系呼吸链失活

丙酮酸 + 丙酮酸 （2）点：通过CO2固定反应生成C4二羧酸，强化这

一反应的方法：添加辅酶生物素

乙酰辅酶A + C4二羧酸

（3）柠檬酸后述的酶的酶活性丧失或很低，控制培养基中的Fe2+

的浓度

柠檬酸

4.说明柠檬酸发酵过程中氧的重要性。 在柠檬酸产生菌体内存在一条侧系呼吸链，该侧系呼吸链中的酶系强烈需氧，如果在柠檬酸的发酵过程中，发酵液的溶氧浓度在很低的水平维持一段时间，或者在这期间中断供氧一段时间（20分钟，根据处理情况如：紧急保压等）则这一侧系呼吸链不可逆的失活，其结果是菌体不再产酸，而是产生了大量的菌体，因为，标准呼吸链的存在使得菌体在代谢过程中产生了大量的ATP，用于菌体自身的生长上，这种现象，在生产上通常称之为：只长菌不产酸 ，大量的葡萄糖被消耗了，却没有生产出柠檬酸，是一种失败

5.简述二氧化碳固定反映对于提高柠檬酸产率的意义。

葡萄糖经过EMP途经生成丙酮酸后，丙酮酸在丙酮酸脱羧酶的作用下生成了乙酰辅酶A(CH3CO-CoA)，则合成一分子柠檬酸需要3分子的CH3CO-CoA，也就是需要1.5分子的葡萄糖；试想，如果其中一分子的丙酮酸通过CO2固定反应生成一分子的C4二羧酸，那么合成一分子的柠檬酸需要1分子的葡萄糖，产率可以大大的提高。

6.比较细菌发酵和酵母发酵的优缺点。 优点：（1）菌体体积较小，相对增殖所用的底物较少，产率高。

（2）细菌的繁殖速度快，在合适的生长条件下，其繁殖速度只有几分钟，而酵母的增殖速度最少在一个小时以上，这就为细菌发酵缩短发酵周期创造了条件。 （3）细菌的细胞膜的通透性易于调节，对于胞外产品，可以通过其细胞膜的通透性控制来促进产物的分泌，例如，GA的发酵；对于胞内产物，其细胞壁比酵母的细胞壁易于破碎。 缺点：（1）细菌菌体较小，当需要从发酵液中把菌体分离出来（有利于产物的结晶提出，或产物就是菌体或菌体内的胞内物），细菌比酵母菌难以分离。（2）细菌发酵过程中的无菌程度要求非常严格，发酵过程中大部分的细菌对于溶氧的要求也很高，这就增加了细菌发酵的生产成本。（3）细菌发酵易感染噬菌体。 细菌赖氨酸发酵使用的菌种通常有两种类型，

7.写出大肠杆菌中Lys代谢途径，说明利用大肠杆菌发酵生产Lys 的菌种特性和控制要点。

Glucose

EMP 丙酮酸

草酰乙酸

Asp

(天冬氨酸激酶AK，同功酶) 天冬氨酸磷酸（asp-p）

天冬氨酸β-半醛

（同功酶）

二羟吡啶羧酸

Lys

Thr Met

大肠杆菌赖氨酸代谢特点：关键酶是天冬氨酸激酶是一个同功酶，分别受三个代谢产物的抑制，这三个终产物分别是：Lys、Met和Thr，只有当这三个代谢产物同时过量时，Asp激酶的活性才能完全被抑制。

控制要点：要使菌体合成并积累Lys，可以选育Hos-，这样的话，既可以解除β—天冬氨酸的代谢支路，使代谢流向Lys的方向进行，提高了从底物葡萄糖到产物的转化率；更重要的是由于Hos-，使得代谢过程中不可能产生过量的Met、Thr，尽管产生了大量的Lys，Lys可以抑制关键酶——天冬氨酸激酶1，但是天冬氨酸激酶2、3的活性由于Met、Thr的限量，并没有受到抑制，也就是说，天冬氨酸β—半醛，仍可以大量的生成，这就保证了Lys的生物合成途径的畅通无阻。

8.写出黄色短杆菌中Lys代谢途径，说明利用黄色短杆菌发酵生产Lys的菌种特性和控制要点。

珀酰高丝氨酸 O-磷酸高丝氨酸 高丝氨酸（Hos）

Glucose

EMP 丙酮酸

草酰乙酸

Asp

(天冬氨酸激酶，AK) 天冬氨酸磷酸（asp-p）

天冬氨酸β-半醛

二羟吡啶羧酸 高 丝 氨 酸

O-磷酸高氨酸

Lys

Met O-琥珀酰高丝氨酸

Thr

特点：（1）天冬氨酸激酶（AK），在黄色短杆菌中是一个变构酶，并有两个活性中心，分别受Lys、Thr的协同反馈抑制。

（2）黄色短杆菌中，存在两个分支点的优先合成机制，如图所示（ ），即优先合成Hos，然后再优先合成Met，当Met过量时，阻遏：催化Hos 琥珀酰高丝氨酸所需要的酶的合成（即，琥珀酰高丝氨酸合成酶），使代谢流向合成Thr的方向进行，当Thr过量时，反馈抑制：Asp-β-半醛 Hos所需要的酶的的活性（即高丝氨酸脱氢酶），使代谢流向Lys的合成上。

控制要点：根据以上代谢特点，利用黄色短杆菌生产Lys，需要选用Hos-，尽管，从理论上讲，选育Hos- 进行赖氨酸发酵，如果在其培养基中限量供给Thr，则AK酶的活性不会受到Lys的反馈抑制，实际上Lys对AK酶的活性存在一定的抑制作用。因此，对于黄色短杆菌的Lys发酵，仅仅选育Hos- 是不够的但是为了高效率的转化Lys，可以选育结构类似物抗性突变株：

(1)S-L-半胱氨酸抗性突变株 AECr (2)γ-甲基赖氨酸抗性突变株 MLr （3）L-赖氨酸氧