教学案

A．培养基是为微生物的生长繁殖提供营养的基质B．培养基只有两类：液体培养基和固体培养基 C．除水以外的无机物只能提供无机盐D．无机氮源不可能提供能量 知识点二 大肠杆菌的纯化培养

3．有关平板划线操作的叙述，不正确的是( )

A．第一步灼烧接种环是为了避免接种环上可能存在的微生物污染培养物 B．每次划线前，灼烧接种环是为了杀死上次划线结束后，接种环上的菌种 C．在第二区域内划线时，接种环上的菌种直接来源于菌液

D．划线结束后，灼烧接种环，能及时杀死接种环上的菌种，避免细菌污染环境和感染操作者 4．下列为某同学在培养金黄色葡萄球菌实验中的部分操作步骤，其中正确的是( ) A．培养基中蛋白胨、牛肉膏溶化后，直接补充蒸馏水至100 mL

B．培养基配制完毕可直接使用C．加压至100 kPa之前，要彻底排出锅内的冷空气 D．将接种环放在酒精灯火焰上灼烧，灭菌后立即伸入菌液试管内挑取少量菌种 四、达标测试(一)、选择题1．关于制备牛肉膏蛋白胨固体培养基，叙述错误的是( ) A．操作顺序为计算、称量、溶化、倒平板、灭菌B．将称好的牛肉膏连同称量纸一同放入烧杯 C．待培养基冷却至50℃左右时进行倒平板D．待平板冷却凝固约5～10 min后，将平板倒过来放置

2．金黄色葡萄球菌有很强的致病力，常引起骨髓炎等，还可能引起食物中毒，下述实验结束后的做法错误的是( ) A．对接种环进行灼烧处理B．带菌培养基必须经高压蒸汽灭菌锅灭菌后才能倒掉

C．带菌培养基必须经加热后才能倒掉D．接种后双手必须经肥皂洗净，再用75%的酒精棉球擦拭 3．防止杂菌入侵，获得纯净的培养物，是研究和应用微生物的前提。下列叙述错误的是( )

A．实验室里可以用紫外线或化学药物进行消毒B．接种环、接种针等金属用具，直接在酒精灯火焰的内焰部位灼烧灭菌C．在实验室中，切不可吃东西、喝水，离开实验室时一定要洗手，以防止被微生物感染 D．使用后的培养基丢弃前一定要进行灭菌处理，以免污染环境 4．下列叙述错误的是( )

A．右手拿装有培养基的锥形瓶，左手拔出棉塞，为避免污染需放在酒精灯火焰附近 B．倒平板整个过程应在火焰旁进行

C．打开培养皿盖，右手将锥形瓶中的培养基倒入培养皿，左手立即盖上培养皿的皿盖 D．为避免水滴滴入培养基，平板应倒过来放置 5．有关稀释涂布平板法的说法中，错误的是( )

A．用移液管把菌液从一支试管转移到下一支试管后，要用手指轻压移液管的橡皮头，吹吸三次，目的是使菌液与水充分混匀B．移液管需经过灭菌C．试管口与移液管应在离火焰1～2 cm处D．涂布时可转动涂布器，使菌液涂布均匀 6．以下关于制备牛肉膏蛋白胨固体培养基的操作顺序正确的是( ) A．计算→称量→倒平板→溶化→灭菌B．计算→称量→溶化→倒平板→灭菌 C．计算→称量→溶化→灭菌→倒平板D．计算→称量→灭菌→溶化→倒平板 7．为了保持菌种的纯净，需要进行菌种的保藏，下列有关叙述不正确的是( )

A．对于频繁使用的菌种，可以采用临时保藏的方法B．临时保藏的菌种一般是接种到试管的斜面培养基上 C．临时保藏的菌种容易被污染或产生变异D．对于需要长期保存的菌种，可以采用低温－4℃保藏的方法 8．有关平板划线操作的叙述，正确的是( )

A．使用已灭菌的接种环、培养皿，操作过程中不再灭菌B．打开含菌种的试管需通过火焰灭菌，取出菌种后需马上塞上棉塞C．把皿盖打开，将沾有菌种的接种环迅速伸入平板内，划三至五条平行线即可D．最后将平板倒置，放入培养箱中培养

(二)、简答题9．某学校打算开辟一块食用菌栽培基地，以丰富学生的劳动技术课内容。首先对食用菌实验室进行清扫和消毒处理，准备食用菌栽培所需的各种原料和用具，然后从菌种站购来各种食用菌菌种。请回答下列问题：

(1)对买回来的菌种进行扩大培养，首先制备试管培养基，写出制备牛肉膏蛋白胨固体培养基所需的原料：________、________、________、________、________。其中提供氮源的是______________；提供碳源的主要物质是________。

(2)微生物在生长过程中对各种成分所需量不同，故配制培养基时各成分要有合适的________。在烧杯中加入琼脂后要不停地________，防止________________________。

(3)将配制好的培养基分装到试管中，加棉塞后若干个试管一捆，包上牛皮纸并用皮筋勒紧放入____________中灭菌，压力________kPa，温度______，时间______________。灭菌完毕拔掉电源，待锅内压力自然降到0时，将试管取出。如果棉塞上沾有培养基，此试管______________。

(4)使用高压蒸汽灭菌锅时注意，先向锅内倒入________，把锅内水加热煮沸并将其中原有冷空气彻底排出后将锅密闭。(5)从一支试管向另一支试管接种时注意，接种环要在酒精灯________(“内”或“外”)焰灭菌，并且待接种环______后蘸取菌种，试管口不能离开酒精灯火焰附

近，将接种的试管放入______℃冰箱中保藏。

10．下表是用于从土壤中分离纯化土壤细菌的牛肉膏蛋白胨培养基的配方。请回答：

试剂 牛肉膏 蛋白胨 NaCl 琼脂 水 用量 5.0 g 10.0 g 5.0 g 20.0 g 1 000 mL (1)培养基的类型很多，但培养基中一般都含有水、碳源、氮源和无机盐。上述培养基配方中能充当碳源的成分是________和________。培养基配制完成以后，一般还要调节pH并对培养基进行__________处理。

(2)分离纯化微生物最常使用的接种方法是____________和______________两种。在接种过程中，接种针或涂布器的灭菌方法是______________。

(3)假设某同学发现培养基上细菌数目过多地连成一片，可能的原因是什么？

教学案：2012-2013-04专题2 微生物的培养与应用微生物的实验室培养 答案 知识清单

一、1.(1)营养物质 生长繁殖 营养基质 (2)水 无机盐 碳源 氮源 特殊营养物质 pH 拓展深化

碳元素 细胞物质 代谢产物 能源物质 氮元素 微量有机物

(3)液体 固体 工业生产 分离 鉴定 天然 合成 选择 抑制 促进 分离 鉴别 鉴别

2．(1)防止杂菌污染 保证培养的纯度 (2)①空间 衣着和手 ②器皿 灭菌 ③酒精灯火焰附近 ④灭菌 (3)①较温和 部分微生物 ②强烈 所有的微生物 芽孢和孢子 ③芽孢和孢子是否存活 (4)煮沸法 巴氏消毒法 化学药剂法 灼烧灭菌 干热灭菌 高压蒸汽灭菌 紫外线灭菌

二、(一)1.(1)目的要明确 (2)营养要协调 (3)pH要适宜 2.(2)计算 称量 溶化 调节pH 分装 灭菌 倒平板 (二)1.平板划线法 稀释涂布平板法 (1)平板划线法

①接种环 ②棉塞 ③火焰 ④沾取 ⑥左手 右手 平板内 ⑦最后一区 第一区 ⑧平板倒置 (2)稀释涂布平板法 ①移液管 ②涂布器 菌液

2．(1)①火焰灼烧灭菌 接种环 ②上一次划线末端 (2)无菌 4．临时保藏 甘油管藏 降低微生物的新陈代谢速率 3～6 对点训练

1．B [对于CO2来说，它为无机物，只能做碳源而不能作为能源物质。] 规律链接 微生物代谢类型与营养的关系： 营养型微生物 碳源 氮源 生长因子 举例 自养型微生物 CO2、NaHCO3 NH3、铵盐、硝酸盐等 一般不需要 硝化细菌 异养型微生物 糖类、脂肪酸等 铵盐、硝酸盐、蛋白质等 有些种类需要 乳酸菌 2.A [根据培养基的物理性质，可分为液体培养基、半固体培养基和固体培养基，在液体培养基中加入不同量的凝固剂如琼脂可形成半固体或固体培养基；除水以外的无机物如NH4HCO3，既可以是碳源，也可以是氮源，不仅仅提供无机盐；无机氮源有时也能提供能量，如NH3可以为硝化细菌提供能量。]

3．C [在第二区域内划线时，接种环上的菌种来源于第一次划线的末端。] 规律链接 (1)无菌技术是微生物培养中的关键环节。掌握无菌技术操作的方法及所适用的条件。时刻建立“有菌”观念，注意操作中的合理灭菌，以杜绝或防止杂菌污染。

(2)平板划线法和稀释涂布平板法都要求最终形成标准菌落。因此，划线或稀释要充分，如果培养基上长出的菌落相互重叠，则说明划线或稀释不充分，应该重新操作。

4．C [培养基的配制应该先加水，后加热溶化，否则培养基会被烧焦；培养基配制完毕要经过灭菌后才能使用；在高压蒸汽灭菌以前，如果高压蒸汽灭菌锅内的冷空气没有排尽，当压力上升到100 kPa时，锅内的温度就不会上升到应有的高度，导致灭菌不彻底；接种时，接种环放到酒精灯火焰上灼烧灭菌是应该的，但不能立即伸入菌种试管内，否则会将菌种烫死。]

达标测试

1．A [制备牛肉膏蛋白胨固体培养基的步骤是计算、称量、溶化、灭菌、倒平板，不能颠倒。牛肉膏容易吸潮，所以当牛肉膏溶化并与称量纸分离后，用玻棒取出称量纸。待培养基冷却至50℃，用手触摸锥形瓶刚刚不烫手，并且培养基处于溶化状态时，进行倒平板。平板冷却5～10 min后还需倒臵。]

2．C [金黄色葡萄球菌有很强的致病力，所以在操作时一定要做到安全防范，接种后双手用肥皂洗净，再用75%的酒精棉球擦拭，以起到杀菌的作用；对接种环进行灼烧也可以杀灭细菌，防止污染环境；高压蒸汽灭菌也可杀死培养基中的金黄色葡萄球菌；如果只对带菌培养基进行加热，杀不尽其中的致病菌，因为此菌的耐高温能力很强，会污染环境。]

3．B [对接种环等金属用具进行灼烧灭菌，应放在酒精灯火焰的充分燃烧层即外焰处。]

4．C 5.D 6.C

7．D [对于需要长期保存的菌种，可采用甘油管藏法，即在3 mL甘油瓶中加入1 mL甘油后灭菌，将1 mL培养的菌液转移到甘油瓶中，与甘油充分混匀后，放在－20℃的冷冻箱中保存。]

8．D [平板划线操作时要时刻注意两个问题：一是防止杂菌污染；二是要尽可能地将菌种分离。]

9．(1)牛肉膏 蛋白胨 水 无机盐 琼脂 蛋白胨 牛肉膏 (2)比例 搅拌 琼脂糊底引起烧杯破裂 (3)高压蒸汽灭菌锅 100 121℃ 15～30 min 废弃 (4)适量水 (5)外 冷却 4

10．(1)牛肉膏 蛋白胨 灭菌

(2)平板划线法 稀释涂布平板法 蘸取酒精；引燃灭菌 (3)菌液浓度过高；培养过程中被杂菌污染；利用接种针划线时，划下一个区域前没有对接种针进行灭菌处理

解析 牛肉膏和蛋白胨都是从天然物质中提取出来的，都含有丰富的有机物，可以为微生物提供碳源和氮源。平板划线法和稀释涂布平板法都能使菌体分散开，但如果操作不当，会使分离效果不理想。

教学案：2012-2013-05专题2土壤中分解尿素细菌的分离与计数

一、明确目标：1.研究培养基对微生物的选择作用。2.进行微生物数量的测定。 二、知识清单：

(一)研究思路1．筛选菌株(1)实验室中微生物筛选的原理

人为提供有利于________________生长的条件(包括营养、温度、pH等)，同时________或________其他微生物生长。

(2)选择培养基：微生物学中，将允许__________种类的微生物生长，同时________或________其他种类微生物生长的培养基，称做选择培养基。(3)分离分解尿素的细菌的选择培养基①在该培养基配方中，为微生物的生长提供碳源的是____________，提供氮源的是________，琼脂的作用是凝固剂。②该培养基对微生物具有选择作用。其选择机制是________________________________才能在该培养基上生长。③土壤中的细菌之所以能分解尿素，是因为它们体内能合成________，将尿素分解的反应式是________________________________________________________。

Taq细菌能忍受93℃左右的高温，是在美国黄石国家公园的一个热泉中发现的，这说明，在寻找目的菌株时，要根据____________________________________________。

2．统计菌落数目的方法：(1)稀释涂布平板法(也叫活菌计数法)①原理：当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的____________，通过统计平板上的________，就能推测出样品中大约含有多少活菌。②操作：一，设置重复组，增强实验的说服力与准确性。将待测样品经一系列10倍稀释，然后选择________稀释度的菌液，分别取0.1 mL接种到已制备好的平板上，然后用无菌涂布器将菌液涂布整个平板表面，放在适宜的温度下培养并计算菌落数。为使结果接近真实值，可将同一稀释度涂布到三个或三个以上的平板上，培养并计算出__________。第二，为了保证结果准确，一般选择菌落数在________的平板进行计数，若设置的重复组中结果相C

差太远，意味着操作有误，需重新实验。③计算公式：每克样品中的菌株数＝×M，其中C代表___________________________，V代表

V________________________________(mL)，M代表____________。

(2)显微镜直接计数法：①原理：此法利用特定的____________或______________，在显微镜下计算一定容积的样品中微生物的数量，但不能区分细菌的死活。计数板是一块特制的载玻片，上面有一个特定的面积1 mm2和高0.1 mm的计数室，在1 mm2的面积里又被划分成25个(或16个)中格，每个中格进一步划分成16个(或25个)小格，计数室由________个小格组成。②操作：将稀释的样品滴在计数板上，盖上盖玻片，然后在显微镜下计数4～5个中格中的细菌数，并求出每个小格所含细菌的平均数，再按公式求出每毫升样品中所含的细菌数。③计数公式：每毫升原液所含细菌数＝每小格平均细菌数×400×10 000×稀释倍数。(3)设置重复和对照：设置重复：培养过程中应设置重复组，同一稀释度下应涂布________个平板，才能增强实验的说服力与准确性。②设置对照：实验中应设置对照，主要目的是________________________对实验结果的影响，提高实验结果的可信度。如__________对照组，观察培养物中是否有杂菌污染；设置________培养基，观察选择培养基是否具有________作用。 （二）设计：实验步骤

1．土壤取样：从肥沃、湿润的土壤中，用无菌小铁铲铲去表层土3 cm左右，迅速取土壤并装入____________密封或事先准备好的________中。

2．制备培养基：①制备________________培养基作为对照组，尿素为唯一氮源的培养基作为________，用来判断选择培养基是否具有____________。

②放宽稀释范围，如稀释倍数为103～107范围内的要分别涂布，而每个稀释度下需要______个选择培养基、________个牛肉膏蛋白胨培养基，因此需要15个选择培养基和5个牛肉膏蛋白胨培养基。

③两种培养基应各有一个作为________对照，此外还需准备8个灭菌的试管和1个灭菌的移液管。

3．样品的稀释与涂布平板：参考下面的实验流程示意图，将10 g土样加入盛有90 mL无菌生理盐水的锥形瓶中(锥形瓶体积为250 mL)，充分摇匀，吸取上清液1 mL，转移至盛有________ mL生理盐水的无菌大试管依次等比稀释至107稀释度，并按照由107～103稀释度的顺序分别吸取______mL进行平板涂布操作。按照浓度从低到高的顺序涂布平板，不必更换移液管。

说明：图中的1、2、3平板是____________，4为____________________作对照，判断选择培养基是否具筛选作用，还有两个空白对照，即不涂布稀释后菌液的选择培养基和牛肉膏蛋白胨培养基，验证培养基中是否____________。 4．将涂布好的培养皿放在30℃温度下培养，及时观察和记录。

5．挑选选择培养基上不同形态的菌落接入含____________培养基的斜面中，观察能否产生颜色反应。 6．细菌的计数

当菌落数目稳定时，选取菌落数在________的平板进行计数。在同一稀释度下，至少对3个平板进行重复计数，然后求出____________，并根据平板所对应的稀释度计算出样品中细菌的数目。同时仔细观察所分离到的菌落，并记录菌落特征。 7．统计表格：一 平板上的菌落数记录表

稀释倍数 103 104 105 106 107 1 2 3 4 1 2 3 4 1 2 3 4 1 2 3 4 1 2 3 4 1 2 3 ? 表二 菌落特征记录表

菌落 种类 1 2 3 ? 形状 大小 隆起程度 颜色 …… 注：一般来说，在一定的培养条件下(相同的培养基、温度及培养时间)，____________表现出________的菌落特征。 （三）提示：

1．取土样用的小铁铲和盛土样的信封在使用前都要________。

2．应在________旁称取土壤。在火焰附近将称好的土样倒入________中，塞好棉塞。 3．在稀释土壤溶液的过程中，每一步都要在________旁操作。

4．实验时要对________做好标记。注明________________________________________等。 5．为了提高效率，在操作时更加有条不紊，应当________________。 （四）结果分析与评价

内容 有无杂菌污染的判断 选择培养基的筛选作用 样品的稀释操作 重复组的结果 （五）课题延伸

在细菌分解尿素的化学反应中，细菌合成的________将尿素分解成了________。氨会使培养基的碱性增强，________升高。因此，我们可以通过检测培养基____________来判断该化学反应是否发生。

在以尿素为唯一氮源的培养基中加入________指示剂，培养某种细菌后，如果pH升高，指示剂将________，这样，我们就可以准确地鉴定该种细菌能够分解尿素。

结论分析 对照的培养皿中________菌落生长→未被杂菌污染 培养物中菌落数________→被杂菌污染 菌落形态多样，菌落数偏高→培养物中混入____________ 牛肉膏蛋白胨培养基的菌落数目________选择培养基的数目→选择培养基具筛选作用，已筛选出一些菌落 得到2个或2个以上菌落数目在________的平板→操作成功，能进行菌落的计数 若选取同一种土样，统计结果应________；如果结果相差太远，说明实验操作过程中出现操作失误，需要找出产生差异的原因