教学案

亚硝酸盐一般情况下不会危害人体健康，因为它们在人体内以“过客”的形式随尿排出体外；但是在特定的条件下，它会转变成致癌物质——亚硝胺，危害人体健康。所以要少吃泡菜，多吃新鲜蔬菜。 2．在泡菜制作过程中，亚硝酸盐含量变化趋势如图所示： 因此，泡菜一般在腌制10天之后食用最好。

4．D [亚硝酸盐具有防腐作用，但是，当人体摄入的亚硝酸盐总量达到0.3～0.5 g时，会中毒；当摄入总量达到3 g时，会引起死亡。] 联想 亚硝酸盐为白色粉末，易溶于水，蔬菜中平均含量为4 mg/kg，咸菜中平均含量为7 mg/kg以上，而豆粉中平均含量可达10 mg/kg。一般不危害人体健康，但摄入量达到0.3～0.5 g时会引起中毒，当摄入量达到3 g时引起死亡。 达标测试

1．C 2．D3．B [泡菜中的亚硝酸盐来自硝酸盐还原菌的作用，将硝酸盐还原为亚硝酸盐。]

4．A [由乳酸菌在有氧气存在时呼吸作用受到抑制的特点可知，大容器中氧气多，抑制了乳酸菌的呼吸作用，而小容器中氧含量少，乳酸菌呼吸作用强，因此，小容器中的乳酸应比大容器中的多。葡萄糖的量则相反，即大容器中的葡萄糖比小容器中的多。] 5．D [婴儿奶粉中亚硝酸盐的平均含量不得超过2 mg/kg。]

6．C [本题考查亚硝酸盐含量测定中有关试剂的配制过程。对氨基苯磺酸溶液需将对氨基苯磺酸溶于20%的盐酸中；提取剂需用浓盐酸调节pH至1，而N—1—萘基乙二胺盐酸盐溶液是将N—1—萘基乙二胺盐酸盐直接溶于水中制成的，不需加入盐酸。] 7．B [亚硝酸盐含量是通过与标准显色液进行目测比较而估算出的，所以只有标准显色液制备标准才能比较出正确的结果。]

8．(1)消毒、杀菌(2)乳酸菌是严格厌氧型微生物 抑制乳酸菌发酵，导致好氧微生物大量繁殖，使发酵失败 (3)盐的浓度过高，使乳酸菌失水死亡，没有生成乳酸，或产生乳酸过少 (4)提供乳酸菌菌种，使其在短时间内形成菌种优势 (5)有机物干重减少，种类增多 解析 本题主要考查泡菜制作过程及条件控制，分析如下：

(1) (2) (3) (4) (5) 9.(1)有氧呼吸

(2)微生物呼吸作用产生的气体、剩余空气 (3)其他微生物活动减慢甚至停止，因为pH不适宜 (4)pH过低抑制了乳酸菌的生长

(5)解析 在泡菜发酵过程初期，由于发酵坛内有少量氧气，所以酵母菌会进行有氧呼吸，并产生CO2气体，随着氧气耗尽，开始进行无氧呼吸，且该过程也会产生CO2气体，且此时产生的气体会增大坛内气压，使产生的气体和剩余空气从坛沿水槽内溢出。随着发酵过程的进行，乳酸不断积累，当积累到一定程度时又会抑制微生物的生长，甚至于杀死微生物。在整个过程

中，亚硝酸盐含量的变化是先升高后降低。

用白酒擦拭的目的是消毒、杀菌，避免泡菜坛中的微生物影响发酵过程 菜坛密封是为了形成无氧环境，为乳酸菌提供适宜环境；若菜坛有裂缝，则会抑制乳酸菌的发酵，导致好氧微生物大量繁殖，使泡菜腐败变质 微生物生长需要适宜的渗透压，若外界浓度过高会使微生物失水死亡，不能完成乳酸发酵 “陈泡菜水”里面乳酸菌含量丰富，利于泡菜的快速发酵 乳酸菌在进行发酵时，将消耗有机物中的能量，同时将大分子物质分解成许多小分子物质

教学案：2012-2013-04专题2 微生物的培养与应用微生物的实验室培养

一、明确目标：1.了解有关培养基的基础知识，掌握无菌操作技术的有关内容。2.了解消毒和灭菌常用的方法及二者的区别。3.学会以大肠

杆菌为材料进行微生物培养与分离纯化的方法。

二、知识清单：(一)、培养基与无菌技术1．培养基(1)概念：人们按照微生物对________________的不同需求，配制出供其________________的________________。(2)成分：一般含有______、________、________、________，此外还要满足微生物对__________________(即生长因子)、________以及氧气的需求。

营养物质 定义 作用 构成生物体的________和一碳源 能提供所需______的物质 些________，有些是异养生物的________ 合成蛋白质、核酸以及含氮的代谢产物 主要来源 无机化合物：CO2、NaHCO3等；有机化合物：糖类、脂肪酸、花生粉饼、石油等 无机化合物：N2、NH3、铵盐、硝酸盐等；有机化合物：尿素、牛肉膏、蛋白胨等 维生素、氨基酸、碱基等 氮源 能提供所需______的物质 特殊营养物质(生长因子) 生长必不可少的__________ 酶和核酸的组成成分 水 在生物体内含量很高，在低等生物体内含量更高 为微生物提供除碳、氮以外的各种重要元素 不仅是优良的溶剂，而且可维持生物大分子结构的稳定 细胞内的组成成分，生理调节物质，某些化能自养菌的能源，酶的激活剂 无机盐 (3)培养基的种类

划分标准 培养基种类 ______培养基 物理性质 半固体培养基 ______培养基 ______培化学 成分 养基 ______培养基 ______培用 途 养基 含化学成分不明确的 天然物质 培养基成分明确(用化学成分已知的化学物质配成) 培养基中加入某种化学物质，以____不需要的微生物的生长，____所需要的微生物的生长 根据微生物的代谢特点，在培养基中加入某种指示剂或化学药品 加凝固剂，如琼脂 特点 用途 ________ 观察微生物的运动、分类、鉴定 微生物____、____、活菌计数、 保藏菌种 工业生产 分类、鉴定 培养、____出特定微生物(如培养酵母菌和霉菌，可在培养基中加入青霉素或链霉素；培养固氮菌可用无氮培养基，如阿须贝培养基) ____不同种类的微生物，如可用伊红—美蓝培养基鉴别饮用水或乳制品中是否有大肠杆菌(若有，菌落呈深紫色，并带有金属光泽) ______培养基 注意 病毒目前不能利用人工培养基来培养，需接种在动、植物组织细胞中才能繁殖。常用于培养病毒的是活鸡胚。 2．无菌技术

(1)概念：防止一切外来杂菌的侵入，并保持灭菌物品及无菌区域不再被污染的方法，称为无菌技术。 注意 在微生物的实验室培养中，无菌技术的核心是________________，________________。 (2)无菌技术的具体内容①对实验操作的________、操作者的________________进行清洁和消毒。 ②将用于微生物培养的__________、接种用具和培养基等进行________。 ③为避免周围环境中微生物的污染，实验操作应在________________进行。 ④实验操作时应避免已________处理的材料用具与周围的物品相接触。 (3)消毒和灭菌的概念

①消毒：消毒是指使用________的物理或化学方法杀死物体表面或内部的________________(不包括芽孢和孢子)。 ②灭菌：灭菌是指使用__________的理化因素杀死物体内外________________，包括____________。 ③消毒与灭菌的区别：两者最大的区别是________________________。

拓展深化 某些细菌在其生长发育后期，可在细胞内形成一个圆形的抗逆性休眠体，称为芽孢。每个细菌细胞仅形成一个芽孢，故它无繁殖功能。芽孢有极强的抗热、抗辐射、抗化学药物和抗静水压的能力。芽孢的休眠能力十分惊人，可保持几年到几十年的生活力。孢子是微生物产生的一种有繁殖或休眠作用的细胞。一般是单细胞，个体微小，通常是适应于从不利环境条件中存活下来，并在条件改变时产生新的营养体，能直接发育成新个体。 (4)消毒与灭菌的常用方法

方法 条件 ____ ____ 消 毒 ____ ____ 70～75℃煮30 min或80℃煮15 min ____ ____ 70%的酒精 ____ 50%的石炭酸、来苏水 对双手消毒 对空气消毒 不耐高温的液体 100℃，煮沸5～6 min 作用对象 杀死微生物的营养细胞和一部分芽孢 ____ 一定浓度的乳酸、食醋 紫外 线法 ____ ____ 紫外线照射30 min 通过熏蒸对空气进行消毒 物体表面或空气中的微生物 对接种环、接种针或其他金属工具灭菌，也可以对试管口、瓶口灭菌 耐高温且需保持干燥的物品，如玻璃器皿和金属用具等 在酒精灯火焰的充分燃烧层灼烧 ____ 在干热灭菌箱内，160～170℃条件下，加热1～____ 2 h 灭 ____ 菌 ____ ____ ____ ____ 30 W照射30 min ____ (二)、实验操作 (一)配制培养基 1．配制原则

在高压蒸汽灭菌锅内，121℃，100 kPa，灭菌15～30 min 小型接种室、接种箱等 (1)____________(根据微生物的种类、培养目的等)，如培养基可由简单的无机物组成；生产用培养基内可加入化学成分不明确的天然物质，而分类鉴定用培养基内必须加入已知化学成分的物质。 (2)____________，注意各种营养物质的浓度和比例。

(3)____________，各种微生物适宜生长的pH范围不同，细菌6.5～7.5、放线菌7.5～8.5、真菌5.0～6.0。 注意 ①不同微生物对营养需求不同，因此，首先根据不同微生物的营养需求配制针对性强的培养基。

②营养物质浓度过低不能满足微生物营养需要，过高对微生物的生长有抑制作用，另外，培养基中各营养物质浓度比直接影响微生物的生长繁殖和代谢产物的形成和积累，其中碳氮比(C/N)的影响较大。例如，在谷氨酸生产中，当培养基中的碳源与氮源的比为4∶1时，菌体大量繁殖，而产生的谷氨酸少；当碳源与氮源的比为3∶1时，菌体繁殖受抑制，但谷氨酸合成量大增。 2．配制方法(以制备牛肉膏蛋白胨固体培养基为例) (1)培养异养菌的牛肉膏蛋白胨固体培养基的营养构成

培养基组分 牛肉膏5.0 g 蛋白胨10.0 g NaCl 5.0 g H2O定容至1 000 mL (2)实验流程

提供的主要营养物质 碳源、磷酸盐和维生素 氮源和维生素 无机盐 氢元素、氧元素

提醒 合格的培养基必须灭菌效果好。培养基配制好后，要放在恒温箱中保温1～2 d，若无菌落生长则说明制备的 培养基是合格的。 (二)纯化大肠杆菌

纯化大肠杆菌就是为了获得大肠杆菌的纯种菌落，这需在培养时，尽量使菌落中的菌体来自于一个大肠杆菌的分裂，即这个菌落的细菌群体由一个大肠杆菌繁殖而来，这就需接种时尽量接种单个的大肠杆菌。 1．微生物接种的方法

微生物接种的方法最常用的是__________和______________两种。

(1)____________通过接种环在琼脂固体培养基表面连续划线的操作，将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基的表面。 ①将________放在酒精灯火焰上灼烧，直到接种环烧红。

②在火焰旁冷却接种环，并打开盛有菌液的试管的______。③将试管口通过酒精灯的________。 ④将已冷却的接种环伸入菌液中，________一环菌液。⑤将试管口通过酒精灯的火焰，并迅速塞上棉塞。

⑥________将培养皿皿盖打开一条缝隙，________将沾有菌种的接种环迅速伸入________，划三至五条平行线，盖上皿盖。注意不要划破培养基。

⑦灼烧接种环，待其冷却后，从第一区域划线的末端开始往第二区域内划线。重复以上操作，在三、四、五区域内划线。注意不要将____________的划线与________相连。 ⑧将____________，放入培养箱中培养。

(2)________________则是将菌液进行一系列的梯度稀释，然后将不同稀释度的菌液分别涂布到琼脂固体培养基的表面，进行培养。 ①系列稀释操作

a．取盛有9 mL水的6支试管灭菌，并按101～106的顺序编号。

b．用________吸取1 mL培养的菌液，注入101倍稀释的试管中。用手指轻压移液管上的橡皮头，吹吸三次，使菌液与水充分混匀。 c．从101倍稀释的试管中吸取1 mL稀释液，注入102倍稀释的试管内吹吸均匀，获得102倍液。依此类推。 ②涂布平板操作

a．将________浸在盛有酒精的烧杯中。

b．取不超过0.1 mL的________，滴加到培养基表面。

c．将沾有少量酒精的涂布器在火焰上引燃，待酒精燃尽后，冷却8～10 s。

d．用涂布器将菌液均匀地涂布在培养基表面。涂布时可转动培养皿，使菌液分布均匀。 2．注意事项 (1)平板划线法

①操作第一步即取菌种之前及每次划线之前都需要进行________________，划线操作结束时，仍需灼烧________。

②从第二次以后的划线操作总是从________________开始，能使细菌的数目随着划线次数的增加逐渐减少，最终得到由单个细菌繁殖而来的菌落。

(2)稀释涂布平板法

稀释涂布平板的操作比较复杂，且各个细节均需保证“________”，应特别注意：

①酒精灯与培养皿的距离要合适。②吸管头不要接触任何其他物体。③吸管要在酒精灯火焰周围使用。 3．微生物分离纯化培养的结果作出分析与评价

(1)培养未接种培养基的作用是对照，若有菌落形成，说明培养基灭菌不彻底。 (2)在肉汤培养基上，大肠杆菌菌落呈白色，为圆形，光滑有光泽，边缘整齐。

(3)培养12 h和24 h后的菌落大小不同，菌落分布位置相同。原因是时间越长，菌落中细菌繁殖越多，菌落体积越大，而菌落的位置不动，只是菌落数增多。

(4)频繁使用的菌种利用临时保藏法保存，长期保存菌种的方法是甘油管藏法。前者利用固体斜面培养基培养后，保存在4℃冰箱中，第3～6个月转种培养一次，缺点是保存时间较短，菌种容易被污染或产生变异；后者将菌种与无菌甘油等量混合后保存在－20℃的冷冻箱中。 4．菌种的保存

为了保持菌种的纯净，需对菌种进行保藏。对于频繁使用的菌种，我们可以采用________________法；对于需要长期保存的菌种，可以采用________________法。将菌种放在低温环境中保藏的目的是________________________，但时间长了菌种还是要老化的，因此对临时保存的菌种________个月后需重新接种。

三、对点训练：知识点一 培养基与无菌技术

1．不同的微生物对营养物质的需要各不相同。下列有关一种以CO2为唯一碳源的自养微生物营养的描述中，不正确的是( )A．氮源物质为该微生物提供必要的氮素B．碳源物质也是该微生物的能源物质 C．无机盐是该微生物不可缺少的营养物质D．水是该微生物的营养要素之一 2．下列说法正确的是( )