肿瘤个体化治疗检测技术指南（试行）20150729

7.5 PCR污染控制

由于肿瘤基因突变检测时必须设置阳性质控品，阳性样本加样时、PCR扩增的产物可能成为PCR实验室的主要污染来源，而PCR的敏感性和效率特别高，所以少量的扩增产物污染样本或反应管即可出现假阳性。尤其是PCR扩增产物和质粒分子很容易造成实验室的污染，导致假阳性现象发生。通过规范实验室设计、规范试剂耗材管理、规范实验室操作和技术处理来控制污染。

常见的PCR污染有样品间交叉污染、PCR试剂的污染、PCR扩增产物污染、气溶胶污染和实验室中克隆质粒的污染。

污染控制：规范实验室设计、规范试剂耗材管理、规范实验室操作和技术处理，如PCR扩增实验中使用dUTP，而不用dTTP。

21

附录A：常见的检测项目 A.1 基因突变检测项目 A.1.1 EGFR基因突变检测

【基因简介】 EGFR是原癌基因c-erbB1的表达产物，是表皮生长因子受体（HER）家族成员之一。HER家族由EGFR/HER1/erbB1、HER2/neu/erbB2、HER3/erbB3及HER4/erbB4四个分子构成，在细胞的生长、增殖和分化等生理过程中发挥重要的调节作用。

【常见突变】 EGFR的突变主要发生在胞内酪氨酸激酶（TK）区域的前四个外显子上（18~21），目前发现的TK区域突变有30多种。缺失突变主要发生在外显子19上，最常见的是del E746-A750，替代突变最常见的是发生在外显子21上的L858R，复制或插入突变发生在外显子20上。发生在外显子20上的替代突变T790M为耐药突变，研究还发现L858Q、D761Y、T854A等耐药突变。 【EGFR基因突变和EGFR-TKI敏感性】 EGFR-KTI的有效性也因突变类型而不同，外显子19缺失突变的有效率为81%，L858R的有效率为71%，G719X的有效率为56%。吉非替尼初期有效的全部患者，在后期均产生耐药。其中50%患者是在19外显子缺失或L858R点突变等的敏感突变的基础上，又发生了第790位密码子苏氨酸向蛋氨酸的突变（T790M）。研究发现有约1～3%的患者在TKI治疗前即存在T790M，即原发耐药，这种情况下TKI治疗难以有效。 【检测样本类型】 经10%中性福尔马林固定、石蜡包埋的非小细胞肺癌肿瘤组织。

【检测方法】推荐ARMS或Sanger测序法进行EGFR突变检测，可考虑采用新一代测序技术同时进行肺癌驱动基因的检测。

【临床意义】 （1）预测药物疗效：EGFR是HER/ErbB家族信号通路的首要分子，吉非替尼、厄洛替尼等小分子TKI进入细胞内，直接作用于EGFR胞内的激酶区，干扰ATP合成，抑制酪氨酸激酶的活性，阻断激酶的自身磷酸化及底物的磷酸化，彻底阻断异常的酪氨酸激酶信号传导，从而阻止配体介导的受体及下游信号通路的激活，阻滞细胞在G1期，促进凋亡，抑制新生血管形成、侵袭和转移，达到治疗的作用。小分子TKI的疗效与EGFR基因突变密切相关，是TKI疗效预测因子。

22

（2）预后评价：根据是否使用EGFR-TKI对肺癌切除后患者进行预后分析，EGFR敏感性突变并服用TKI的患者至少在单因素分析中有预后良好的趋势。但是，EGFR基因突变与女性、非吸烟者等这些传统的预后良好因子有交叉，只分析基因突变进行预后评价几乎是不可能的。

【用药建议】（1）吉非替尼、厄洛替尼等小分子酪氨酸激酶抑制剂的疗效与EGFR基因发突变密切相关，特别是当第19外显子缺失、第21外显子突变（L858R）和第18外显子突变（G719X）的患者，使用吉非替尼、厄洛替尼等小分子TKI可获益。

（2）约1~3%未经TKI治疗的NSCLC患者第20外显子存在T790M突变，但经TKI治疗后超过50%后耐药的患者出现T790M突变阳性，导致TKI治疗失败。也有报道认为L747S、D76IY、T854A突变阳性时，患者也会对吉非替尼、厄洛替尼等小分子酪氨酸激酶抑制剂耐药。

【局限性】临床实践表明，并不是所有携有EGFR突变的NSCLC患者都对酪氨酸激酶抑制剂有效，EGFR-TKI的有效性因突变类型而不同，如对外显子19缺失突变的肿瘤患者有效率为81%， L858R的有效率为71%，G719X的有效率为56%，而有些患者发生第20外显子插入突变却对TKI无效。另外，约10%的EGFR野生型NSCLC患者对酪氨酸激酶抑制剂有效，但其机制尚不明确。 A.1.2 KRAS基因突变检测

【基因简介】 哺乳动物基因组中普遍存在三种RAS癌基因家族成员：H-RAS、K-RAS、N-RAS，这三种基因编码的蛋白质大约有90%的氨基酸同源序列，分子量均为21kDa，故称为RASp21蛋白，其在功能上与G蛋白相似，可与二磷酸尿苷（GDP）结合为非活性状态，与三磷酸尿苷（GTP）结合为活性状态，RASp21 蛋白自身具有弱GTPase活性，位于细胞膜内侧参与跨膜信号传递作用。KRAS基因是RAS基因家族中三种癌基因的一种，位于12号染色体上，含有4个编码外显子和1个5’端非编码外显子，共同编码含189个氨基酸的RAS蛋白。KRAS是表皮生长因子受体功能信号的下游分子，属膜结合型GTP／GDP结合蛋白，通过GTP和GDP的相互转化作用有节制的调节KRAS基因对信号系统的开启和关闭，传递细胞生长分化信号。

23

【KRAS基因的常见突变】KRAS基因突变发生在肿瘤恶变的早中期，并且原发灶和转移灶的KRAS基因状态基本保持一致。目前研究发现，KRAS基因在膀胱、乳腺、直肠、肾、肝、肺、卵巢、胰腺、胃，还有造血系统等均在一定频率的突变，其中以结直肠癌、胰腺癌和肺癌的发生率比较高，在胰腺癌组织高达90％以上，在肺癌中则以肺腺癌为主，突变率为20～30％，结直肠癌患者突变率为27～43％。当KRAS基因催化活性区突变时，该基因永久活化，不能产生正常的RAS蛋白，导致RAS蛋白不依赖EGFR受体激活而持续活化，造成RAS信号通路的异常活化，影响细胞的生长、增殖和分化，促进细胞的恶性转化，导致细胞增殖失控而癌变。

KRAS基因最常见的突变方式为点突变，90％的KRAS基因突变位于2号外显子的第12和13密码子位点，另有1～4％为第61和146密码子突变。其中结直肠癌中第12密码子（约82％）是最常见的突变位点。一般中国人群样本检测数据G12A高于G12S/C，西方人群相反。

【检测样本类型】 经10%中性福尔马林固定石蜡包埋的结肠癌/肺癌肿瘤组织，或者与原发灶具有同样病理形态的转移组织。

【检测方法】可以采用Sanger测序法，也可采用灵敏度高的ARMS-PCR等。 【临床意义】 西妥昔单抗和帕尼单抗均通过直接抑制EGFR从而发挥抗肿瘤的作用，在结直肠癌和头颈部癌的靶向治疗中都有肯定的效果。西妥昔单抗治疗的有效性受其下游基因KRAS状态的影响，突变型的KRAS无需接受上游EGFR信号即能够自动活化该通路并启动下游信号的转导。因此只有KRAS基因野生型的患者才能从抗EGFR的治疗中获益，而突变型的患者则不能。

【用药建议】KRAS野生型患者使用西妥昔单克隆抗体和帕尼单克隆抗体治疗效果确切，可显著提高患者的生存率和改善生活状态，建议使用；而KRAS的2号外显子的12号密码子和（或）13号密码子或其他密码子任意突变型患者使用西妥昔单抗和帕尼单克隆抗体抗治疗无效，建议不使用该类药物。而在进行结肠癌靶向药物治疗时，应询问所有结肠癌患者的家族史，如果怀疑患者有遗传性非息肉病性结直肠癌(HNPCC)、家族性腺瘤性息肉病(FAP)和轻表型家族性腺瘤性息肉病(AFAP)，除非是进行临床试验，否则不应使用贝伐珠单克隆抗体、西妥昔单克隆抗体、帕尼单克隆抗体或伊立替康。

24