凯式定氮及氨基态氮测定

凯式定氮及氨基态氮测定

氨基, 测定

蛋白质的测定 一、概述 （一）蛋白质的组成

蛋白质是复杂的含氮有机化合物，它由20多种氨基酸通过酰胺键以一定的方式结合起来，并具有复杂的空间结构。它主要含的元素是C 、H、O、N、S、P另外还有一些微量元素Fe、

Zn、I、Cu、Mn。而含N是蛋白质区别于其他有机化合物的重要标志。

（二）氨基酸的组成

pro是由氨基酸组成的高分子化合物，目前各种氨基酸已达175种以上，但是构成pro的氨

基酸主要是其中的20种。 （三）食品中pro的含量及测定意义

蛋白质是人体重要的营养物质，测定食品中的蛋白质含量，对合理调配膳食，保证不同人群的营养需求，掌握食品的营养价值，合理开发利用食品资源，控制食品加工中食品的品

质、质量都具有重要的意义。

1. pro是组成人体的重要成分之一，人体的一切细胞都由pro组成

2.pro维持体内酸碱平衡

3.pro 是食品的重要组织成分之一，也是重要的营养物质 4.pro 是评价食品质量高低的指标，还关系到人体健康。

为什么说pro关系到人体健康？

如果膳食中pro长期不足，将出现负氮平衡，也就是说每天体内的排出氮大于抗体摄入氮，

这样造成消化吸收不良导致腹泻等。

对于一个体重65公斤的人来说，若每天从体内排出氮3.5g（其中尿液排出2.4g，粪便0.8g，皮肤0.3g），一般以pro含氮100/16计算的话，3.5g相当于pro含量22g（6.25*3.5），也就是说每日至少通过膳食供给22g pro，也能达到氮平衡，即摄入体内的氮数量与排出氮

的数量相等。所以我们说pro对人体健康影响很大。 （四）蛋白质的测定方法和蛋白质换算系数。

1、方法

目前测定蛋白质的方法分为两大类：

一类是利用pro的共性，即含氮量，肽链和折射率测定pro含量，

另一类是利用蛋白质中特定氨基酸残基、酸、碱性基团和芳香基团测定pro含量。 最常用的方法是凯氏定氮法。此外，双缩脲分光光度比色法、染料结合分光光度比色法、酚试剂法等也常用于蛋白质含量测定。近年来，国外采用红外检测仪，利用一定的波长范围内的近红外线具有被食品中蛋白质组分吸收和反射的特性，而建立了近红外光谱快速定

量法。

2、蛋白质换算系数

对于不同的蛋白质，它的组成和结构不同，但从分析数据可以得到近似的pro的元素组成

百分比。 元素组成百分比：

元素 C H O N S P 百分比 50 7 23 16 0～3 0～3

一般来说，pro的平均含氮量为100/160，所以在用凯氏定氮法定量pro时，将测得的总氮%

乘上pro的换算系数K=6.25即为该物质的pro含量。

但是我们必须要知道，当测定的样品其含氮的系数与上面100/16相差较大时，采用6.25

将会引起显著的偏差。

不同的蛋白质其氨基酸组成及方式不同，所以各种不同来源的蛋白质，其N量也不相同，一般蛋白质含N量为16%，即1份N素相当于6.25份蛋白质，此系数称为蛋白质换算系数。 食品不同，蛋白质组成也不同，蛋白质换算系数也有差异。如：玉米、荞麦为6.25, 花生：

5.46；大米：5.95；大豆及其制品：5.71；面粉：5.70；乳制品：6.38；

二、凯氏定氮法

凯氏定氮法是目前普遍采用的测定有机N总量较为准确、方便的方法之一，适用于所有食品，所以国内外应用较为广泛。是经典的分析方法之一，也GB中的第一方法，由于该法是

丹麦人道尔（J.Kjeldah）于1883年提出用于测定研究蛋白质而得名。

凯氏定氮法是将蛋白质消化，测定其总N量，再换算成为蛋白质含量的凯氏定氮法。食品中的含N物质，除蛋白质外，还有少量的非蛋白质含N物质，所以该法测定的蛋白质含量

应称为粗蛋白质。

凯氏定氮法有常量法、微量法及改良法，其原理基本相同，只是所使用的样品数量和仪器不同。而改良的常量法主要是催化剂的种类、硫酸和盐类添量不同，一般采用硫酸铜、二

氧化钛或硒、汞等物质代替硫酸铜。

有些样品中含有难以分解的含N化合物，如：蛋白质中含有色氨酸、赖氨酸、组氨酸、酪氨酸、脯氨酸等，单纯以硫酸铜作催化剂，18小时或更长时间也难经分解，单独用汞化合

物，在短时间内即可，但它有毒性。 下面主要介绍微量凯氏定氮法 （一）原理【教材(P114)】

食品与硫酸和催化剂一起加热消化，使蛋白质分解，其中C、H形成CO2及H20逸去而氮以氨的形式与硫酸作用，形成硫酸铵留在酸液中。将消化液碱化、蒸馏，使氨游离，随水蒸气蒸出，被硼酸吸收，用盐酸标准溶液滴定所生成的硼酸铵，根据消耗的盐酸标准溶液的

量，计算出总氮量，反应式如下：

2CH3－CH－COOH+13H2SO4=（NH4）2SO4+6CO2↑+12SO2↑+16H2O↑

∣ NH2

1、（NH4）2SO4+2NaOH=2NH3↑+Na2SO4+2H2O

2、2NH3+4H3BO3=(NH4)2B4O7+5H2O 3、(NH4)2B4O7+HCL+5H2O=2NH4CL+4H3BO3

反应（1）、(2)在凯氏瓶内完成，反应（3）在凯氏蒸馏装置中进行。

（二）方法摘要

Kjeldah法测定蛋白质含量主要分三个步骤：

1、消化

样品中的有机物和含N有机化合物，经浓H2SO4加热消化，H2SO4使有机物脱水，炭化为碳；碳将H2SO4还原为SO2，而本身则变为CO2；SO2使N还原为NH3，而本身则氧化为SO3，而消化过程中所生成的新生态氢，又加速了氨的形成。在反应中生成物CO2、H2O和SO2、SO3

逸去，而NH3与H2SO4结合生成（NH4）2SO4留在消化液中。

蛋白质+H2SO4——→C C+H2SO4——→SO2+CO2↑ SO2+[N]——→NH3+SO3↑ NH3+H2SO4——→（NH4）2SO4

2CH3－CH－COOH+13H2SO4=（NH4）2SO4+6CO2↑+12SO2↑+16H2O↑

∣ NH2

浓硫酸具有脱水性，使有机物脱水并炭化为碳、氢、氮。浓硫酸又有氧化性，使炭化后的

碳氧化为二氧化碳，硫酸则被还原成二氧化硫：

二氧化硫使氮还原为氨，本身则被氧化为三氧化硫，氨随之与硫酸作用生成硫酸铵留在酸

性溶液中：NH3+H2SO4——→（NH4）2SO4

2、碱化、蒸馏

（NH4）2SO4在碱性条件下，加热蒸馏，释放出氨。

（NH4）2SO4+2NaOH=2NH3↑+Na2SO4+2H2O

3、吸收、滴定

蒸馏过程中所放出的NH3，可用一定量的标准硼酸溶液吸收，再用标准盐酸溶液直接滴定。

2NH3+4H3BO3=(NH4)2B4O7+5H2O (NH4)2B4O7+HCL+5H2O=2NH4CL+4H3BO3

硼酸溶液仅呈极微弱的酸性，在此反应中并不影响所加的指示剂的变色反应，但具有吸收

氨的作用，所以采用之作吸收剂。

（三）试剂

所有试剂，如未注明规格，均指分析纯；所有实验用水，如未注明其他要求，均指三级水。

1、硫酸(密度为1.8419g/L)

2、硫酸钾

3、硫酸铜(CuSO4?5H2O) 4、硼酸溶液(20g/L) 5、氢氧化钠溶液(400g/L)。

6、混合指示液：1份甲基红乙醇溶液(1g/L)与5份溴甲酚绿乙醇溶液(1g/L)临用时混合。也可用2份甲基红乙醇溶液(1g/L)与1份亚甲基蓝乙醇溶液(1 g/L)临用时混合。变色点pH=5.4，呈灰色；酸色为红紫色，碱色为绿色。【GB/T 5009.5-2003食品中蛋白质的测定

Determination of protein in food】

注

婴幼儿配方食品和乳粉蛋白质的测定GB5410—1999)配制方法:甲基红-溴甲酚绿混合

指示剂：用体积分数为95%的乙醇，将溴甲酚绿及甲基红分别配成1g/L的乙醇溶液，使用

时按1g/L溴甲酚绿：1g/L甲基红为5：1的比例混合。

7、硫酸标准滴定溶液[c(1/2H2SO4)=0.0500mol/L]或盐酸标准滴定溶液

[c(HCl)=0.0500mol/L]。 8、过氧化氢溶液：体积分数为30%。

9、乙戊醇 （四）仪器设备

1、100mL凯氏烧瓶 2、龙科A—凯氏定氮仪 3、扭力天平 4、分析天平 5、5mL移液管 6、温度可以控制的电炉 7、小漏斗 8、酸式微量滴定管 9、150mL锥形瓶

（五）分析步骤 1、试样处理准备

称取0.20g～2.00g固体试样或2.00g～5.00g半固体试样或吸取10.00mL～25.00mL液体试样(约相当氮30mg～40mg)，移人干燥的100mL或500mL定氮瓶中，加人0.2g硫酸铜,6g硫