本科生六个基本生物学实验

实验五 DNA限制内切酶技术

1. 原理：

限制性内切酶（即限制性核酸内切酶，简称限制酶或内切酶）是一类能识别双链分子中特异核酸序列的水解酶，这类酶的发现和应用，促进了基因工程和DNA序列测定以及基因诊断技术的发展。它的应用是当代分子生物学研究最基本、最重要的技术手段。

从质粒、噬菌体或粘性质粒获得的含有目的基因重组分子，必须经过酶切、电泳分离、回收基因片断，方可用于重组或探针标记。根据酶切的目的不同，可采用小量酶切或大量酶切反应两种体系。

2．实验材料

2.1 质粒SNAT1-PBK-CMV⊿(600ng/ul，150ul) 2.2 限制性内切酶EcoRI 2.3 1kb DNAmarker

2.4 离心管，枪头，移液器，离心机，恒温水浴锅，琼脂糖凝胶电泳所需材料 3.小量酶切反应体系

本实验主要应用于质粒的酶切鉴定。典型的反应是20μl体积中含0.2—1μgDNA，酶切反应体系如下：

质粒DNA 5μl 10×缓冲液 1μl 限制酶（根据质粒酶切位点选择） 1μl 双蒸去离子水 3μl

总体积 10μl

4.操作方法

4.1 在一灭菌的新的Ep管中加入3μl双蒸水。 4.2 加入10×缓冲液1μl。 4.3 加限制酶1μl。

4.4 最后加入质粒DNA 5μl。 4.5 稍离心，混合。 4.6 37℃水浴1—1.5h。

4.7取出后电泳分析鉴定是否酶解。 5.注意事项

5.1 双蒸水为可变体积，当其他反应成分的量确定后，用双蒸水将反应体积补足。

5.2 质粒DNA最后加入，以防止操作不当引起试剂的污染。

5.3 为保持限制酶的活性，将酶从低温冰箱取出后立即置于预先准备的碎冰中冰浴，操作应迅速，用后立即放回低温冰箱中。

5.4 大多数酶多以浓缩液存放，吸取时需严格取量。若要取用多种酶，每种酶必须单独使用吸头，避免交叉污染。

5.5 大多数限制酶均加50%甘油缓冲液置于-20℃保存，其活力稳定，但在配制反应混合物时，酶的加入量要准确限制小于体积的1/10，否则甘油会抑制酶解反应。

5.6 如欲节省酶的用量，可增加酶解时间，但酶解时间过长，易出现异常条带。

5.7 当样品加入反应管之后，必须将装酶试管盖盖严，避免温育时水蒸汽进入管内。

6. 结果观察

6.1 DNA分子中分布的酶切位点的多少与酶解后条带呈正比。仔细观察条带数量。

6.2. 与Marker 对照，观察各条带中的bp数。 6.3. 书写实验记录并画图记录各条带的位置。

实验六 PCR技术

1. 原理：

PCR技术实际上是一个在模板DNA、引物和四种脱氧核苷酸等存在的情况下，DNA聚合酶依赖的酶促反应，扩增的特异性取决于引物与模板DNA的特异结合。整个扩增过程分为三步：①变性：加热使模板DNA双链间的氢键断裂而形成两条单链；②退火：突然降温后，模板DNA与引物按碱基配对的原则互补结合。也存在2链之间的结合，但由于引物的高浓度、结构简单等特点，主要结合发生在模板与引物之间；③延伸：在DNA聚合酶及镁离子存在时，从引物的3`端开始、结合单核苷酸，形成与模板互补的新的DNA链。上述三步为一个循环，理论上讲，每经过一个循环，样本中的DNA量应该增加一倍，新形成的链又可成为下一轮模板链循环的模板， 经过25-30个循环后DNA可扩增106-109倍。

2.操作方法

针对本次实验的实验材料，体系和条件如下： PCR产物约800bp （一） 材料：

2×Taq聚合酶：康为世纪

模板：GFP-SNAT2-pBK-CMV⊿（56ng/ul） 上游引物：12.5uM，35ul

（5，-3，CGTAATATTAGCGCGCATGTGATCGCGCTTCTCGTTGGG） 下游引物：12.5uM，35ul

（5，-3，CGTACATATGCGCGCCACTTTATGCTTCCGGCTCGTATG）

（二）10ul体系：

ddH2O： 2.36ul 2×Taq聚合酶：5ul

上游引物： 0.67ul 下游引物： 0.67ul

模板： 1.3ul 总体积： 10ul

（三）PCR条件： 1, 94℃ 2min

2c， 94℃ 30s 3c, 66.1℃ 30s 4c, 72℃ 1min 5, 72℃ 10min 6, 4℃ ---- 循环数25，Total time：1h 42min 反应结束后，短暂离心。

3. 注意：1）Taq酶活性；2）模板和引物的浓度。 4. 结果观察

4.1 电泳结束后，将琼脂糖凝胶置凝胶分析仪中，在紫外灯下观察PCR产物的电泳位置。

4.2 与DNA marker对照，准确描述目标产物的bp数 （800bp）。 5.写实验报告