第八讲单链噬菌体载体及噬菌粒载体

*2.KS表示多克隆位点区的另一种取向，即lacZ基因是按照KpnI→SacI方向转录的。

*3.(+/-)表示单链噬菌体f1复制起点的两种相反取向。 pBluescript噬菌粒载体的结构特征：

pBluescript噬菌粒是从pUC19派生而来的分子量为3204bp的噬菌粒载体。它带有如下主要组成部分：

*1.1个ColE1质粒的复制起点——产生双链DNA *2.1个氨苄青霉素抗性基因——供作转化子克隆的选择记号

*3.1个来自pUC19的多克隆位点区——用以克隆外源基因

*4.围绕多克隆位点区(MCS)两侧的T3和T7启动子——指导外源基因的转录活性

*5.1个lacZ基因——供Xgal-IPTG显然反应，选择重组子

*6.1个M13复制起点——产生单链DNA

pBluescript噬菌粒结构特征：

图5-40 pBluescript SK(+/-)噬菌粒载体的分子结构图

它是从pUC19质粒载体派生而来的。SK表示多克隆位点区的一种取向，即lacZ基因是按照SanI→KpnI的方向转录的；反之，KS则表示多克隆位点区的另一种取向，即lacZ基因是按照KpnI→SacI方向转录的。(+/-)表示单链噬菌体f1复制起点的两种相反的取向。其中，f1(+)起点表示，当pBluescript噬菌粒载体和辅助噬菌体共感染寄主细胞时，能够回收到lacZ基因的有意义链DNA，即-半乳糖苷酶基因的编码链DNA；而f1(-)起点则表示，当pBluescript噬菌粒载体与辅助噬菌体共感染寄主细胞时，可回收到lacZ基因的无意义链DNA，即-半乳糖苷酶基因的非编码链DNA。

(3) pBluescript噬菌粒载体的体外转录

*1. pBluescript噬菌粒载体具有双向转录功能的原理。 在该噬菌粒载体的MCS序列区的两侧，分别存在着两个启动子，即T3和T7。因此当某一特定的外源DNA插入在MCS上的任何位点上，便有可能发生两种不同的体外转录反应：

图5-41 pBS(+)噬菌粒载体的多克隆位点区之插入DNA片段的体外转录作用 (a)pBS(+)多克隆位点的结构，示限制性位点顺序；(b)T3启动子指导的体外转录，合成出(-)链的RNA转录本，其重组体分子被SmaI切割线性化；(c)T7启动子指导的体外转录，合成出(+)链的RNA转录本，其重组体分子被XbaI切割线性化。

MCS中限制酶位点的顺序：

自T3启动子至T7启动子的顺序是：

T3-Sph1-Pst1-SalI-XbaI-BamHI-SmaI-KpnI-SacI-EcoRI-T7 a.(-)链RNA转录本的合成

从MCS中限制酶位点顺序可知，自T3启动子起动的转录反应，使外源插入DNA中的(-)链转录成mRNA，叫做(-)链RNA转录本(见上图b)。 b.(+)链RNA转录本的合成

自T7启动子起动的转录作用，使外源插入DNA分子中的(+)链转录成mRNA分子，叫做(+)链RNA转录本(见上图c)。

(4) pBluescript噬菌粒载体的用途

pBluescript噬菌粒载体在基因工程及分子生物学研究中用途广泛，主要的有如下几点：

a. 制备同位素标记的DNA杂交分子探针：

—— 基因文库或cDNA文库筛选；Southern杂

交及Northern。

b. 制备克隆基因的转录本 c. 合成克隆基因编码的蛋白质

5．pUC118和pUC119噬菌粒载体

(1)pUC118和pUC119噬菌粒的分子结构

① 这一对噬菌粒载体是由质粒pUC18和pUC19和野生型噬菌体M13的基因间隔区(IG)重组而成。

② 在M13的IG间隔区(长476bp)具有M13的复制起点。 ③ pUC118和pUC119两个噬菌粒载体除了MCS区序列取向彼此相反之外，两者的分子结构完全相同。