米曲霉 - 图文

2.2 米曲霉发酵产有机酸的研究与应用 2.2.1 发酵产曲酸

曲酸是一种具有抗菌作用的有机酸,对水果、蔬菜有护色作用,还可以消除人体内自由基,同时 具有抑制黑色素生成酶活性的能力,还可用作摄影、胶片去斑剂等,因此在食品、化妆品、农业、医药、化工等行业有着广阔的应用前景。董静[17]等人研究了复合诱变对米曲霉2336产酸量的影响,经过紫外线、60Co诱变筛选出1株不产黄曲霉毒素且高产曲酸、能利用玉米淀粉为碳源的变异株。 2.2.2 发酵产圆弧偶氮酸

圆弧偶氮酸是一种神经毒。赵珊[18]等人利用反相高效液相色谱法分析米曲霉发酵液中的圆弧偶氮酸。该方法为米曲霉代谢产物研究开辟新径。

30总第350期 中国调味品 霉作为牲畜的益生素

益生素是一种含有大量有益菌及其代谢产物和生长促进因子的活菌制剂,它能维持肠道微生 物平衡、提高机体健康水平。1994年我国批准了6种益生菌菌株可以使用,其中包括米曲霉(其余5种为芽孢杆菌、乳酸杆菌、粪链球菌、酵母菌和黑曲霉)。米曲霉及其提取物对牲畜、家禽的消化功能、生产功能都有很大影响。孙安权[19]等人研究了米曲霉提取物对瘤胃生态及奶牛生产性能的影响。瘤胃是反刍动物的一种特殊的消化器官,在消化过程中起到很重要的作用。

此项研究表明,米曲霉发酵提取物艾美福(Amaferm)通过刺激纤维素分解菌的生长,提高

纤维素酶的产量,提高饲草中纤维的消化率,改善反刍动物瘤胃生理功能,稳定瘤胃pH值,从而达到降低奶牛代谢疾病,提高反刍动物的生产性能及体况,显著提高奶牛抗热应激的能力。Han等人(1999)通过对产蛋鸡饲喂米曲霉益生素的实验得出结论:不能排除外源性米曲霉在胃肠道中与内源性菌群有协同互作的作用。Grimes等(1997)进行了一项试验,以测定米曲霉和黑曲霉的发酵产物Fermacto\福美多\对产蛋母鸡的功效。Fermacto是我国农业部批准进口美国培一埃公司生产的益生素饲料添加剂。试验结果表明,向产蛋母鸡日粮中添加0.1%的米曲霉益生素可以影响营养元素消化、调节胆固醇代谢及肠道菌群,并减少氨气的产生。

3研究结果

以米曲霉A-29菌株为出发菌株，进行发酵培养和产酶菌株的筛选。研究结果表明，米曲霉A-29在豆米粉7.5%、（NH4）2SO40.8%、水40%、KH2PO40.25%、麸皮51.45%的固体培养基上产酸性蛋白酶活力最高，发酵温度为30℃，最适发酵时间为72ｈ。

酸性蛋白酶是一种适合在酸性条件下水解蛋白质为小肽和氨基酸的酶类。酸性蛋白酶的条件： (1）、pH值适应性 酸性蛋白酶作用的最适稳定pH范围在2.0～4.0之间，最适pH3.0，低于2.0，高于4.0将影响水解速度。曲霉属一般在3.0以下。 （2）、温度适应性 酸性蛋白酶一般在50℃以下可保持稳定，曲霉属所产的酶在50℃仍稳定，但在55℃处理10分钟就失活。 （3）、金属离子对酶活力地影响 酸性蛋白酶可被Mn2﹢、Ca2+、Mg2+离子激活，被Cu2+、Hg2+、Al2+离子抑制，液体酸性蛋白酶，长时间存放碳钢罐中将失活较多。

4.材料及仪器

4.1 材料和试剂 培养基：

1. 麦芽汁斜面培养基：取已制备好的麦芽汁，调糖度为8%，加2%琼脂，PH自然，融化

后分装试管，121℃，高温蒸汽灭菌20分钟，制成斜面培养基。 2. 优化出的酸性蛋白酶最佳正交培养基：豆米粉7.5%、（NH4）2SO40.8%、水40%、

KH2PO40.25%、麸皮51.45%。

菌种：米曲霉A-29,保存菌株的培养基为麦芽汁斜面培养基。 4.2发酵方法 1. 菌株的转接

将米曲霉A-29在无菌操作条件下使用接种环接入斜面培养基中，并置于恒温培养箱中29℃培养96h，使之全部孢子化后取出备用。 2. 固态发酵培养

在500ml三角瓶中装入固体发酵培养基，玻璃棒搅匀后，121℃下灭菌20分钟，冷却后在超净工作台上将转忠后的菌株孢子接入装有固态培养基的三角瓶中，每个培养基接2～3环孢子，混匀。然后置于恒温培养箱中29℃培养72h. 2.3分析方法 1. 酶的提取

称取发酵后的培养物2.0g，用80ml缓冲液在研钵中捣碎充分溶解，然后将混合液经滤纸过滤，取滤液5ml加蒸馏水定容至100ml，既得稀释800倍的待测酶液。 2.酸性蛋白酶酶活的测定

a.先将酪素液放入40±0.2℃恒温水浴中预热5分钟 b.测定：

在试样管中，取经40±0.2℃预热2分钟的稀释酶液1.0ml，加入预热的10g/l酪素溶液1.0ml，于40±0.2℃保温10分钟，立即加入0.4mol/l的三氯乙酸溶液2.0ml以终止反应。在空白对照管中，取经40±0.2℃预热2分钟的稀释酶液1.0ml，先加入0.4mol/l的三氯乙酸溶液2.0ml，于40±0.2℃保温10分钟，再加入预热的10g/l酪素溶液1.0ml。将上述的试样管和空白对照管取出静止10分钟后过滤，取1.0ml滤液，加入0.4mol/l碳酸钠溶液5.0ml，再加福林试剂1.0ml，40±0.2℃水浴中显色20分钟取出，冷却后在680nm处测定吸光度。

4.3酸性蛋白酶酶活的计算

酸性蛋白酶酶活的定义：1g固体发酵产物，在乳酸缓冲液中，于40℃的条件下，一分钟分解酪蛋白产生一微克的酪氨酸称为一个酶活单位，以U/g表示。 计算公式：X=A×K×v/t×n=2/5×A×K×n

X:样品酶活力 A：样品平行实验平均吸光度 K：吸光常数 v：反应体积（本实验v=4） t=反应时间（本实验t=10）n：稀释倍数

注：平行误差不超过3%，并且本实验中如果没有特殊说明，菌体的重量都是指发酵后的菌体湿重。

4.4结果与讨论

通过查阅相关资料发现，麸皮、豆饼粉以及微量的无机盐是米曲霉产酸性蛋白酶培养基所必需的，因此选取3个配方，进行固态发酵培养，以考查米曲霉A-29菌株的生长性能以及产酸性蛋白酶能力。

① 麸皮48%，豆饼粉49.9%,磷酸二氢钾0.10%，硫酸铵2%，固体：水=10:9 ② 麸皮73%，豆饼粉24.7%,磷酸二氢钾0.30%，硫酸铵2%，固体：水=10:9 ③ 麸皮78%，豆饼粉19.8%，磷酸二氢钾0.20%，硫酸铵2%，固体：水=10:9

研究结果表明，米曲霉A-29菌株在①号培养基上生长缓慢，且菌株的孢子化程度不高，产酶水平较低；②号培养基菌株生长情况与①号相似但菌株总量较大，酶活力水平提高不大；③号培养基的菌株生长情况良好，菌株孢子化程度较好，酶酶活力水平很高。因此以

③号培养基为基础，设设计正交试验。 4.5 a.米曲霉A-29固态发酵培养基优化 在基础培养基③中，选取豆饼粉（A）、（NH4）2SO4（B）、KH2PO4（C）、水（D）等4个因素，按表所示的因素水平进行正交实验，实验设计及结果如下：

培养基配比正交实验设计与结果 /% 序号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 A 6.75 6.75 6.75 7.50 7.50 7.50 8.25 8.25 8.25 B 0.6 0.8 1.0 0.6 0.8 1.0 0.6 0.8 1.0 C 0 0.125 0.25 0.125 0.25 0 0.25 0 0.125 D 40 50 60 60 40 50 50 60 40 酸性蛋白酶活 12963.06 13863.72 12577.06 14571.38 17273.36 13735.06 13445.56 12416.23 12609.23

由表可见，实验组5的酸性蛋白酶酶活有最大值17273.36u/g，实验组8的酸性蛋白酶酶活有最小值 12416.23u/g,实验组4的蛋白酶酶活达到14571.38 u/g，其他组合酸性蛋白酶酶活均几乎在13000～14000 u/g之间。

X1 X2 X3 R A 13134.61 15193.27 12823.67 2369.60 B 13660.00 14517.77 12973.78 1543.99 C 13038.12 13681.44 14431.99 1393.87 D 14281.88 13681.45 13188.22 1093.66 经比较极差R,可见RA>RB>RC>RD，即实验所设定的因素中，豆饼粉对米曲霉产蛋白酶水平的影响大，水的影响最小。得到酸性蛋白酶生产最佳因素组合为序号5，即最适培养及配比（%）为：豆饼粉7.5、（NH4）2SO40.8、水40、KH2PO40.25、麸皮51.45。

豆饼粉对米曲霉A-29产酸性蛋白酶的影响

经数据分析，酸性蛋白酶的酶活水平随着培养基中豆饼粉的增加呈“钟”型分布,当豆饼粉量过低或过高时都不利于酸性蛋白酶的生产。 （NH4）2SO4

对米曲霉A-29产酸性蛋白酶的影响

（NH4）2SO4可作为发酵中的无机氮源，经分析发现，浓度在2时，最适酸性蛋白酶的生产。其原因可能是由于浓度过高会使培养基的pH太低，而浓度过低则不能保证菌株正常的氮源需求所致。

KH2PO4对米曲霉A-29产酸性蛋白酶的影响

根据有关文献的报道，磷酸盐对蛋白酶的生产很重要，它具有稳定蛋白酶的功能。分析表可知，磷酸盐在0.25%时，即水平3时最适合酸性蛋白酶的生产。这一结果也再次证明磷酸盐具有稳定蛋白酶的功能。

水量对米曲霉A-29产酸性蛋白酶的影响

固体发酵的特点在于，它是在培养基呈固态，虽然含水丰富，但没有或几乎没有自由流动水的状态下进行的一种或多种微生物发酵过程。随着培养基中水量的增加，米曲霉的产酶水平是呈逐渐降低的趋势，可见该发酵过程过量水的加入将对酸性蛋白酶的产生有一定抑制作用。这也许主要是因为随着水的加入，固态发酵培养基在发酵过程中更容易结块，培养基紧密度的增加，将使米曲霉生长时的透气性较低，对米曲霉的生长造成了抑制，因而影响产酶能力。 b. 米曲霉

A-29固态发酵工艺优化

①．培养时间的影响

考察米曲霉A-29在29℃分别培养24～84h米曲霉产酸性蛋白酶的情况，其产酶结果如表所示，可看出29℃下进行发酵，随着时间的增长，酸性蛋白酶的生产呈现直线增加趋势，但在72h达到最大值，最大值为17337.69U/g，超过72h后发酵产物的酶活逐渐下降。这主要是由于米曲霉A-29在产酸性蛋白酶的同时，酸性蛋白酶也在失去活性，当发酵所产生的酶与同时被分解失活的酶量差值最大时，所测酶活将出现最大值，即72h时。当超过72h后，由于菌体的孢子化程度加强，产酸性蛋白酶的能力相应降低，但酸性蛋白酶的分解率没有发生变化，因而其酸性蛋白酶酶活逐渐降低。 时间/h 24 36 48 60 72 84 200001800016000140001200010000800060004000200001234561 0.115 0.258 0.371 0.508 0.561 0.474 2 0.152 0.305 0.326 0.442 0.524 0.487 3 0.143 0.266 0.325 0.432 0.552 0.478 4 0.123 0.224 0.328 0.504 0.517 0.502 平均吸光度 0.133 0.263 0.338 0.472 0.539 0.485 平均酶活/u.g-1 4278.13 8459.76 10872.24 15182.54 17337.69 15600.70 系列1系列2系列3系列4系列5系列6系列7

②．培养温度的影响

由图可知，30℃下培养的产物的酸性蛋白酶酶活最高，27℃下培养的产物的酶活与33℃下培养的产物的酶活大致相同。因此，米曲霉A-29的最佳培养温度是30℃。27℃时温度低蛋白酶的失活速率小，但同时菌体的生长性能也受到了抑制。33℃时温度高，使酸性蛋白酶失活速率加快，其酶活也不会太高。30℃时菌体孢子化较慢，且酸性蛋白失活速率也相对较缓慢，酸性蛋白酶的酶活就很高，因此菌株在30℃时出现产酶最高峰。 温度/℃ 1 2 3 4 平均吸光度 平均酶活/u.g-1