细胞模型建立的指导原则和标准操作规范第一版 - 图文

行混合，以免造成稀释药物的损失。 6.收集细胞的原则：

细胞收集是细胞模型建立和模型细胞鉴定的后期步骤，需要注意很多细节，以保证模型细胞结果的真实性。由于每次细胞模型的分组都是多组实验，第一组与最后一组在收集完细胞后的时间间隔很长，后几组细胞很可能在发生一定的变化（时间结点延长不准，细胞可能发生增殖等），因此需要将收集的细胞放在冰上，将组间时间因素的差距减少到最低。

7. CO2培养箱的观察

CO2培养箱的工作正常也是细胞模型建立是否成功的关键： （1） 每次离开无菌间时，要观察CO2培养箱的温度、CO2 表的压力是 否在设定的工作范围内、水槽中水的有无和水位的高度，要及时补充水位的高度符合要求，见《HERAcell 150i CO2培养箱操作规程》 （2）观察CO2培养箱的四壁是否长有霉菌和细菌生长，如有生长要对培养箱进行彻底清理和高温消毒。

（3）定期进行CO2培养箱的清洁消毒和保养。详细操作见《HERAcell 150i CO2培养箱操作规程》、《二氧化碳供气系统安全使用操作规程》和《HERAcell 150i CO2培养箱清洁规程》

日期 CO2培养箱观察记录 温度CO2减压器高压CO2减压器低（37℃） 表压力 压表压力 记录人 注：请仔细填写表格内容，时间写全（年 月 日 小时 分钟）。CO2表压力填写正常和不正常。

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二、细胞模型的评价标准

细胞模型评价的标准，是细胞模型建立成败的客观参数。其标准如下： （一）细胞形态的观察 诱导的细胞模型细胞，一般是与没有诱导的细胞株细胞有很大形态差异。

（1）与对照组比细胞数量减少、明显减少、增多或细胞数量没有增减；

（2）细胞生物学行为发生改变，原来悬浮的细胞可能变得贴壁或半贴壁。

（3）细胞死亡或凋亡增加，有大量的细胞碎片。 （4）细胞由原来的圆形变为多角形或梭形。

（5）细胞质内有更多的颗粒，有多个细胞核，胞浆丰富，细胞体积明显变大。

流式检测对细胞模型的评价

NO\\SP作用Dami细胞模型的流式细胞仪结果评价 1．理想结果 0h

散点图上信号分布较均匀一致（集中），SSC和FSC左交界处细胞信号分布稀疏（表示死细胞或碎片），说明细胞状态良好，细胞分布均匀。设门圈定分析其DNA倍性显示二倍体和四倍体峰分离清晰，变异系数小（峰窄）。 2.不理想结果 0h

SSC和FCS-H左侧下对交点处信号分布密集，表明死细胞和细胞碎片较多。说明细胞状态较差，设门圈定分析其DNA倍性显示二倍体和四倍体细胞峰分离不清晰，变异系数较大。 3.理想结果48h NO

诱导出四倍体和八倍体细胞，峰高变异系数小，在非设门圈定图显示，NO药物作用较强，向下箭头显示较多的死细胞，表明药物毒性较大。 4.不理想结果 48h NO

散点图上信号分布较不均匀（集中），SSC和FSC左交界处细胞信号分布密集（表示死细胞或碎片），说明细胞状态不理想，细胞分布不均匀。设门圈定分析其DNA倍性显示四倍体和八倍体峰分离不清晰，变异系数大（峰宽矮）。说明四倍体和八倍体没有诱导出来，门外有大量死细胞，细胞状态不能耐受NO诱导或不起反应。 5.理想结果48h SP

同理想结果48h NO结果。不理想结果同 48h NO。 第五部分 附件

附件1. 0.5 M EDTA（pH8.0，50ml）配制

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分子量MW.292.24

292.24×0.5×0.05(L)=7.31g

称取7.31g EDTA，置于100ml烧杯中，加入20 ml双蒸馏水充分搅拌。用10M NaOH调节pH值至8.0（注意：pH值至8.0时，EDTA才能完全溶解），再加双蒸馏水定容至50ml。高压灭菌或过滤除菌，分装，室温保存。

注意： EDTA溶液应贮存于硬质玻璃瓶内，避免与橡皮塞接触。 附件2. 0.4%台盼蓝配制 台盼蓝粉剂 0.4g

PBS 加至100ml 4℃过夜溶解 新华滤纸过滤

分装：分装于青霉素小瓶中，每瓶5ml 保存：2～8℃保存数年 室温储存2年

附件3. 清洁液的配制方法

清洁液常用的配制方法是将浓硫酸(96％)缓缓加入到水中．这样不仅限制了配制的量．同时也增加了取酸的危险性。通过长期的工作实践．在配制清洁液的过程中．先加入少量的硫酸于水中(约为配制量的5％)后，再将此稀酸液加入到浓硫酸中去，具体方法如下： 处方：

重铬酸钾 800g. 水500ml．

96％浓硫酸加至10000ml。

取重铬酸钾加入到500ml水中加热使溶解．趁热缓缓加入500ml浓硫酸，随加随搅拌．待加完后，立即将此稀酸液加入到约9000ml的浓硫酸中．并随加随搅拌补充浓硫酸至10000m1即得。此种方法具有以下优点①由于配制的过程中需取用的酸量少(5％)．从而减少了取酸的危险和麻烦。②此法在配制后来见有重铬酸钾析出。③经应用与传统的将浓硫酸加入到水中的方法相比具有很强烈的氧化作用。 主要产生有强氧化作用的铬酐，从而达到去热原及去污作用。④盛酸的容器不需加热，可以缩短时间，而且可以一次性的大量配制 附件4.培养体系使用的注意事项：

1.培养基的储存条件是2～8℃。如果细胞培养基不小心被冻，应该融化培养基并观察是否有沉淀产生。如果没有沉淀产生，培养基可以正常使用，如果出现沉淀只能丢弃这些培养基。 2.储存在冰箱中的瓶口已经开启的培养基，可能在放置几天后颜色变紫。这主要是由于在暴露到周围的CO2水平时，碳酸氢钠导致了pH

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值的上升。可以在使用前松开瓶口，将培养基放置在CO2培养箱中培养10～15min，来校正溶液的pH值（确定松开瓶口以保证气体交换）。 3.当在无血清培养基中添加抗生素时，血清蛋白会结合和灭活一些抗生素。在无血清培养条件下，抗生素不被灭活，可能会对细胞达到毒性水平。

4.一旦在新鲜培养基中添加了血清和抗生素时，应该在两到三周内使用。因为一些抗生素和血清中的基本成分在解冻后开始降解。

5.部分添加物和试剂最多可以冻融3次，如果次数多会 引起一定水平的蛋白质降解和沉淀。

6.血清的灭活在免疫分析时可以灭活补体系统。在免疫学研究，培养ES细胞,昆虫细胞和平滑肌细胞时，推荐使用热灭活血清。热灭活是以往公认的操作步骤，并没有确凿证据说明这样做是有益的。相反，对大部分细胞而言，有些厂家不推荐热灭活血清。因为加热可能使血清中的沉淀增加。

7.避免血清中沉淀的产生;(1)解冻血清时，按照所建议的步骤解冻法（-20℃至4℃至室温），若血清解冻时改变的温度太大（如-20℃至37℃），非常容易产生沉淀物。（2）勿将血清放置37℃太久。血清会变得浑浊，同时血清中许多较不稳定的成分也会因此受到损害，而影响血清的质量。（3）血清的热灭活非常容易造成沉淀物的增多，若非必要，可以无需作此步骤。（4）如必须做血清的灭活，要遵守56℃ 30min的原则，并且随时摇晃均匀。温度过高，时间过久或摇晃不均，都会造成沉淀物的增多。 8.在进行传代培养时，要知道细胞的群体倍增时间，强烈推荐进行台盼蓝活性计数、固定传代时间和固定传代密度方法传代细胞。使得细胞生长状态保持均一。

9.储存在4℃冰箱中的液体胰蛋白酶溶液只能使用一周。胰蛋白酶在4℃就可能开始降解，如果在室温下放置超过30min，就会变得不稳定。

10.在订购的细胞到达后，应立即复苏，如果培养基没有准备好，可将其放入液氮中，尽快复苏。绝不允许放置在-20℃或-80℃的冰箱中。 11.细胞复苏往往是比较容易出问题的步骤，请在订购细胞时就向供应商索取详细的复苏步骤，并仔细阅读。有些供应商就不推荐在复苏时离心，对此类细节，应该特别留意。国内的主要细胞库：ATCC(细胞株及胚胎干细胞库)

(1)下载细胞库目：http://www.atcc.org/pdf/tcl.pdf （2） 查询细胞株：

http://www.atcc.org/SearchCatalogs/CellBio logy.cfm （3） 胚胎干细胞库：

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