显微与电镜技术

于电磁透镜存在的球差和色差，不能用光学中常用的发散和会聚透镜的方法来消除。因此，电磁透镜的像差是影响成像质量的主要因素。 四、成像原理

1、电子光学与几何光学的比较

电子光学与几何光学有相似性，但也有原则区别，几何光学中的光线是相互作用的带电粒子流，而且具有质量的概念。电子光学系统的电磁透镜对电子射线的折射不是连续性的，而是在其边界上突然折射的，因而对于几何光学中透镜成像存在的像差就可以借助凹凸透镜的互相配合来消除，而电子光学系统的电子透镜要消除像差和球差就比较困难。

２、电子显微镜的成像

电子显微镜的成像原理和普通光学显微镜的成像原理是有原则上不同的。普通光学显微镜中，当照明源的光束透过样品的各组织结构时，由于样品与光子流的相互作用，产生不同程度的吸收、反射、折射和散射，因而形成明暗不同的组织结构影像。在电子显微镜中，当电子束在几万伏特的加速电压作用下，以极高的速度投射到样品上，此时高速电子和样品中的原子必然发生碰撞，因而便会产生弹性和非弹性散射，有部分电子被样品吸收，也有部分电子透过样品。在电子显微镜，电子的能量有很小一部分损失了，电子射线中的电子速度则逐渐减小，当电子束穿过样品时，某些被阻止（吸收）的电子能量则完全丧失，而另外一些能穿过样品的电子就失去绝大部分能量，由于电子能量的损失就使其电子的速度发生了很大差别，速度悬殊的电子束不能用来成像，因为它们会造成很大的像差。由于电子显微镜的样品很小，一般用2或3毫米的铜网来承载样品，要求样品很薄（若20-50NM左右）。如果样品太厚，受阻的那些电子会放出能量，使们品产生漂移和像模糊，有时还会使样品很快烧坏，也有可能由于样品吸收了过多的电子，电子间相互作用的静电斥力会使标本裂开。为了避免样品被烧坏或裂开，在电子显微镜中利用了散射现象。当高速电子投射到很薄的样品时，电子由于弹性和非弹性散射击的作用而改变了运动方向，当极细的平行电子束穿过样品以后，以某一立体角发射开来，散射角与样品的密度及厚度有关，在样品后面有很小孔径的光阑，样品的某些组织的一些部分厚度（密度）越大，则电子束通过这些部分时所产生的散射角也就越大，透过样品后的散射击角度较小，穿过光阑孔的电子束就较强，像的亮度就大。因而在荧光屏上像的亮度与样品的厚度是负相关。

第二节 电子显微镜的结构

透射式电子显微镜的电子光学光路与普通光学显微镜的光路，看起来十分相似，但两者在结构上完全不同。电子显微镜是由电子光学系统—镜体、真空系统、供电系统三部分组成的。 一、镜体

镜体由电子枪、聚光镜（分第一、第二聚光镜）、物镜、中间镜、投影镜和观察记录机构所组成。电子枪的灯丝当加热到2500℃以上时即发射热电子，这些电子被几十千伏或更高千伏值的阳极加速，这种电子束经聚光镜将其截面积缩小，照射到样品上而被样品散射，物镜将标本形成第一次像，然后再经中间镜和投影镜进行二次放大成像于荧光屏上，屏下的照相底版，需要记录时，将荧光屏移开即可把像记录下来。 （一）、照明系统 １、 电子枪：电子枪是电子发射源， 即电子显微镜的电子光源。它的作用相当于普通显微镜的照明光源。要求具有足够的发射强度，发射的电子束截面小，并且电子束的强度是可调的。电子枪由阴极、栅极和阳要组成，实际上是一个静电透镜，它能将阴极发射出来的电子会聚到小于100微米的束径。

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２、 聚光镜：它的作用是将来自电子枪的电子束会聚于样品上，用它控制照明强度和照明孔径角。电子显微镜有用单聚光镜的，也有用双聚光镜的。一般分辨率为2-5NM的透射式电子显微镜用单聚光镜，分辨率在1。0NM以内的透射式电子显微镜均用双聚光镜。 （二）、成像系统

1、样品室：位于聚光镜之下、物镜之上，可承载样品和移动样品，包括机械手、样品台、样品杯、曲柄杠杆、样品移动控制杆和冷指等部件，要求样品台通过机械手能方便取出样品或放入样品。样品台能在垂直光轴的二个互相垂直的方向横向移动（其可动间隙约为正负1毫米），使样品能从一边移动另一边，并牢固，精确地保持在同一物面上。 样品载物通常是非常薄的胶膜（多用火棉胶薄膜），或在胶膜上加碳膜。薄膜支持在具有许多孔的铜网上。国内常用的铜网直径为3毫米，厚为50-100毫微米。

样品室还具有一气锁装置，在换样品时，只有微量气体进入镜筒，这就能在最短时间内恢复工作真空。

2、物镜：物镜是电子显微镜最关健的部件，由具有非磁性材料间隙的带铁壳的线圈和具有高导磁率材料（一般为纯铁或钻合金）制成的极靴所组成。这个透镜中的任何缺陷都将被电子光学系统中的其它透镜所放大。物镜具有较短的焦距，放大率较大。

为减小球面像差和提高像的衬度，在物镜的径向装有物镜光阑。光阑片用钼片或紫铜片制成，片上有一排小孔，孔径为0。02毫米、0。03毫米、0。05毫米、0。07毫米，换用不同的孔径可改变物镜成像之孔径角及衬度强弱，所制作的光阑孔要求边缘完整。

3、中间镜和投影镜：中间镜和物镜联成一体，不需互对中心。中间镜和投影镜的结构与物镜基本相似，由非导磁性材料间隙的带铁壳的线圈和高导磁材料制成的极靴所组成。其焦距比较长，它的作用是将经物镜放大几十倍或几百倍的电子像再进行二级放大，最后成像于荧光屏上。

中间镜是可变倍率的弱透镜，用于控制总放大率，可以很方便地在较大范围内调节放大。 （三）、观察和记录系统

人眼不能直接看到电子射线，所以电子像必须通过电子轰击荧光屏成像进行观察或电子直接照射在特殊的感光材料上记录下来。荧光屏一般由硫化物或硅酸盐类再加以微量金属为微活化剂组成，当荧光屏受到电子轰击后就发荧光，其亮度是电子数量和速度的函数，因此在荧光屏上可以看到明暗不同的标本像。为了能正确地调焦和看清楚某一区域，可用观察放大镜将屏上的像再放大5-10倍进行观察。当主为在荧光屏上观察到的像有必要拍成照片加以记录时，可将荧光屏移开，使置于屏下的照相底板在电子直接轰击下感光成像。经过显影、定影后，视需要再进行若干倍的光学放大，即可得到清晰的照片。

直接观察一般均通过观察室正面和两侧之视窗，窗为铅玻璃密封，以防射线漏出损害使用和观察者。观察窗上备有塑料盖，不进行观察时应将窗盖上，防止荧光屏受到可见光刺激而老化。

位于荧光屏下的照相室，备有底片接受盒和可交替使用装底片的暗盒，一只使用时，另一只可事先放大底片预抽室预抽。盒内装底片36张，每张底片上有编号，倍率等记录。 二、真空系统

电子显微镜对于电子束通道（即镜筒的空间）的真空度要求很高。镜筒部分的真空好坏，是电子显微镜能否正常使用的关健之一。 真空系统由机械泵、油扩散泵（或离子泵）、联动阀门、真空管道和真空度测量仪表等组成。其作用是利用机械泵和油扩散泵（或离子泵）从镜筒、样品室、观察室、照相室和底片预抽室中把气体抽出来，使电子显微镜筒保持在10-4毫米汞柱以上的高真空状态，这样，才能保证在电子束的通道中，高速的电子不会与气体分子互相碰撞而发生电子散射，才能防止电离和放电，真空度如劣于10-3毫米汞柱，则会加速高温灯丝氧化而缩短灯丝的寿命。真空度优于10-4毫米汞柱还可防止样品污染。

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三、供电系统

电子显微镜对电源的稳定性要求很高，电子显微镜的供电系统包括电源供给，电子稳压器、电子稳流器、高压发生器、电子枪灯丝等部分。由于一般交流电电压的波动很大，有时可能在？？20%的范围内上下波动，因此由市电输入到电子显微镜的电源经过初步稳定后，需进一步稳定，然后供给各系统。供电系统包括稳压器，稳流器和高压发生器等。

第二章 扫描电子显微镜

近十年来，在研究微观世界的先进设备中，出现了扫描电子显微镜之后，不论物理学、冶金学、材料科学、半导体技术、石油、地质、化工等等工业技术部门还是医疗卫生、药物、病理、临床等学部门；特别是家林部门有关动物、植物、昆虫及他们的生态、生化、遗传等研究中；甚至在外贸、公安侦察部门中，都竞相使用和配备了扫描电镜，用这种新技术来解决各方面提出的理论研究课题和大量的实际问题。从1942年英国剑桥大学摩伦（D.M.Muiian）在奥特雪（C.W.Oatley）的指导下，制出了世界上第一台扫描电镜的实验性装置（分辨率为500-1000nm）后，1965年剑桥大学仪器公司又生产了世界第一台商品扫描电镜，其分辨率为50-100nm.放大倍数由几十倍到一万倍，照相时间为200秒，得到了很大焦深的立体图像，这在各行各业引起了广泛的重视。从而开始了飞速的发展，仪器的性能结构在短短十几年中得到大步提高和改进，附件不断增多，使用极其广泛。

最近，一种低压扫描电镜用于观察生物样品，把扫描电镜的分辨率提高到透射电镜的水平（2-3nm），最高可达0.8nm。其原理是当扫描电压从30kv降至1.5kv时，电子束对样品的损伤大大减小，样品表面的电荷积累也大大减少，电子束穿透能力也减弱，这样发出的二次电子更接近样品表面，不需喷镀金属或仅喷极薄一层即可，这样看到的样品结构既真实，分辨率又大为改观。美国科学院院士，威斯康星大学教授Hans Ris用这种高分辨率低压扫描电镜观察爪蟾孵细胞核表面，结合立体独到的令人折服的根据。由于SEM分辨的提高，观察DNA的结构甚至在SEM下直接识别核甘酸有可能成为现实。

第一节 扫描电镜的一些基本概念

扫描电镜的要领和术语许多与透射电镜相同，下面只就与透射电镜不同的几个总是作简单的介绍：

一、图象的分解和扫描的意义：

任何一张丰富多姿，形态复杂的照片，都可以看作是由许多明暗相间的小点所构成。和伟真照片一样。这些小点的排列汇集，组成了一幅图像，这些点也就是这幅图像的基本单元。在光学上称为“像素”。像素的多少，使最终表现的图像质量差别很大，传真照片的像素少，仅十万个，所以看上去图形没有连性贯，反映不出的细节，电影约有一百万个像素，故看不出像素之间的间隔，给人以细微清晰的感觉，如同看到实体一样。所以像素越多，图象质量越好。

在扫描电镜中，必须充分反映细节特征，才能确保图象质量，立体感和分辨率，一幅图像要求一百万个以上像素，否则仪器的高分辨率将形存实亡。但如果一味提高数量，则将因结复杂而成倍增加仪器之成体，那种超过人眼分辨能力和显像管及照相材料的分辨能力的过分要求，是没有实际意义的，目前超高分辨率的扫描电镜采用2500行扫描，总像素为八百万个，在特别的照相材料上，可获得质量很高的照片。 二、景深和三维结构

物体有它的平面方向，还有表示厚度或深度方向的立体形态，构成了它的三度空间结构，一张平淡的照片，只反映出长、宽方向的形态。而一幅景深大的图像，给人以一种有一定厚度的立体感觉。这种能表达纵深方向层次细节的程度就叫做“景深”，扫描电镜正因为有较好的景深，所以图像立体感很强。

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在扫描电镜中，物镜光阑孔的大小有类似照相机的光圈的作用。光阑孔小，景深大。另外，也可以用改变物镜的工作距离来改变景范围，样品离物镜越近，物镜聚焦电流就越大，电子束交叉角大，类似于广角镜头，景深也大。在扫描电镜中景深还与放大倍数N，分辨率和电子束斑直径等有关。

第二节 扫描电镜的原理及特点

扫描电镜是一种综合性的精密仪器，主要由电子光学系统、信号接收显示系统和真空系统三大部分组成，此外，也有自动控制，自动补偿，图像处理等等部件和附件。

在整个结构中，影响图像质量最大的除电子枪、电磁透独、光阑等，也在透镜部分介绍过，下面着重介绍一下： 一、偏转扫描机构：

电子束的偏转机构，是扫描电镜的一个独特部件，它使电子束作光栅扫描运动，而不同于透射电镜那样垂直行进。它是由两组小的电磁线圈构成，这两组线圈内的电流不是恒定的，而是随时间而线性改变强度锯齿波电波。 二、检测器：

给扫描电镜配不同的检测器，可以付予其不同的功能，最常用基本的是二次电子检测器，它可将带有样品信息的二次电子讯号转换成光的强弱变化，由导光管送到光电倍增管加以放大转换电讯号，输出到视频放大器后去调制显像管的亮度。

扫描电镜最基本成像功能是二次电子成像，它主要反映样品外表面的立体形貌，由于样品的表面是高低参差不一，凹凸不平，电子束轰击的受力角度不同，激发角度就不一样，激发出二次电子的量也不同，二次电子向空间散射的角度和方向也不同。因此，二次电子的数量是样品表面特征和入射角的函数。 三、扫描电镜的特点：

扫描电镜之所以应用广泛，是由于它具有许多重要的特点： （一）分辨率高：

目前扫描电镜普通能达到分辨率是6。0——7。0NM，比最好的光学显微镜高三十倍以上，而且还在不断提高，场致发射扫描电镜的分辨率已达1NM以上，是分子水平，透射扫描电镜已接近原子水平，与中型透射电镜相当，是光学显微镜无法比拟的。在这样高的分辨率下，细胞结构早已暴露无遗了，现在向观察大分子的细微形貌及原子的排列而努力。对大多数生物样品来说，6-7NM的分辨率已能满足各个方面的要求。

（二）景深长，视野大，成像富有立体感

如果我们看一物体，只能看到平面，而看不到立体形态，看不到一定的深度的三维空间的话，那是很不方便的。我们对微细结构也要尽可能把它的浓度反映出来，扫描电镜在这方面有独到之处，它不受样品大小和厚度的限制，对表面凹凸不平的样品也能直接观察，给人们以很强的立体感和真实感，这种特点，对于形态分类学的研究工作，实在是很重要的。

（三）成像的倍率范围广：

光学显微镜的倍率变化要不断更换物镜和接目镜，使用不方便，即使连续变倍的立体显微镜，其变化范围也有限。扫描电镜的倍率变化是用电位器调节电磁场透镜电流的大小来达到，所以很方便、轻巧、快速，又可以连续地从几倍变到一、二十万倍，其范围非常广，在观察时，可以先从样品的全貌或一个很大区域（如5厘米见方）一直观察到只有几纳米的小微区，调节只用一、二分钟，这确是很方便的。对于生物样品，是否有电荷积累，在高倍时电子束集中在一个很小的微区时，样品能否受得了，是一个值得注意的问题。

（四）试样制备简便：

金属等导电的试样，可以直接放入扫描电镜中观察，对于非导电的试样，可以在真空中将表面喷涂一层金属薄层（如金等），或在较低的加速电压下直接观察。对于生物试样，虽

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