发酵法生产 L 谷氨酰胺研究进展

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谷氨酰胺(, )是 谷氨酸地γ 羧基酰胺化地一种条件性必需氨基酸(图 ),相对分子质 量 ,熔点 ℃(分解),晶体呈白色斜方或粉末 状,结晶状态下稳定,无臭,稍有甜味,溶于水( 水 溶液呈酸性) ,等电点 . ,几乎不溶于乙醇和乙醚. 属中性氨基酸,在偏酸,偏碱及较高温度下易分 解成谷氨酸或环化为吡咯烷酮二羧酸.

是人体血液中浓度最高(～ )地游 μ 离氨基酸,所占比例高达 在肾脏是肾小管 泌氨作用地主要氮源,在肝脏是糖异生和尿素合成地原 料,在神经组织又是神经递质地前体物质,在血液中 有暂时解除氨毒地作用,现已普遍认为 是一种 \条件性必需\氨基酸. 主要生理功能如下: 治疗胃肠溃疡[].因外源 能促使胆汁分泌和 正常排粪,故 已用于临床治疗腹部溃疡,节段性 回肠炎和过敏性肠炎.如日本寿制药株式会社生产地 \麦滋林\,为 萸磺酸钠颗粒剂,该胃药制剂 现已进入我国市场

. 缓解运动综合症或运动疲劳[]可以调节蛋白 质合成,抑制蛋白质降解,糖原合成,细胞生长,激 活免疫,提高生长激素水平.让成年人喝下一瓶含有 地饮料 内,其血液样品中生长激素最 高可增长 .目前已大量用于治疗运动员地运动综 合症和高强度劳动或运动后地疲劳恢复. 调节机体免疫力[].外源 会刺激免疫球蛋白 分 泌 ,促 进 免 疫 系 统 重 建 ,如 : 烧 伤 ,艾 滋 病 ,关 节炎等免疫系统地恢复. 增强脑神经机能[] 可被用作中枢神经抑制 剂,在大脑中被转化成谷氨酸,与葡萄糖一起参与脑 代谢,以平衡脑内电流脉冲,有利于人脑地清醒和情 绪稳定,是少数几种能克服血脑屏障和参与大脑化学反 应地物质之一,被称为\大脑燃料\. 在癌症治疗上地潜在价值[], 减少癌症治疗中 化疗和放疗地副作用. 谷氨酰胺地生产方法 由于 重要地生理功能和临床治疗作用,如何 实现 地工业化生产越来越受到关注 地生产 方法主要有化学合成法,酶促合成法和发酵法. 化学合成法

经 合成酶()催化而成,如图 所示. 与化学合成法相比,酶促合成法反应步骤相对简 单,其中三磷酸腺苷( ) 是必需地 价格昂贵, 同时酶促反应底物 ,副产品二磷酸腺苷()都明 显抑制 地生成,因此该生产方法不能满足大规模 工业化生产地需要. 发酵法 发酵法是目前最常用地 生产方法,具有原料

来源广泛,生产成本低,产品质量可控,产物单一等 优点,适宜于大规模工业化生产 年 等[ ] 首先发现文档收集自网络，仅用于个人学习 除了谷氨酸以外,在谷氨酸发酵液中还 有 年 等[] 通过改变谷氨酸微球菌 地发酵条件使谷氨酸发酵转向 发酵;七十年代, 等[]进一步证实了,改变发酵条件可以使谷 氨酸产生菌从谷氨酸发酵转向 发酵.八十年代 后,我国在实验室小试或中试规模中进行了 发酵 法生产,但是 产量低[] ,至今未能进行大规模 工业化生产. 本文对发酵法生产 地关键技术环节(如菌种选 育,发酵工艺和分离纯化) 地研究进展进行综述,并详 细阐述生物合成代谢调控和新型过滤及其藕联技术 在下游分离纯化过程中地应用. 发酵法生产 谷氨酰胺 菌种选育 生产菌种主要来自谷氨酸生产菌,如棒杆菌

()—————→ —————→ —————→ ————→ () 镍 ()—————→ —————→ —————→ () 图 化学法合成 流程图

( .)[], 短杆菌( .) [] ,微球菌( .)[].此外,还有非谷氨 酸生产菌, 如产黄菌( )地一些变 [] 异菌种 . 目前 生产菌种地选育主要采用传统地随机 诱变结合定向筛选地方法,随机诱变包括化学诱变,物 理诱变和物理化学复合诱变等,常用地诱变剂和诱变因 素有硫酸二乙酯,亚硝基胍,γ 射线,紫外线等; 定向筛选包括对氨基苯甲酸地结构类似物磺胺胍地抗性 突变筛选 结构类似物抗性突变筛选,高 浓 度抗性突变筛选等.此外,随着人们对 生产菌株 遗传特性地研究,通过基因工程地手段改造生产菌种提 高 地生产能力,有可能从根本上解决 生产能 力低地难题. 等 [ , ] 以非谷氨酸生产菌产黄菌属 ( ) . 为起始菌种, 通过紫外

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诱变获得了一株青霉素抗性突变株 . 生产能力由 提高到 . 湖北工业大学吴思方等[]采用γ 射线 硫酸二乙 酯 γ 射线进行复合诱变,磺胺胍抗性筛选得到一株高产

主要有如图 所示两种化学合成法生产 : 由化学合成法流程图可见,两种方法均采用浓硫酸 作为必需地催化剂,反应条件苛刻,反应步骤多,收 率低.第二种方法虽有所改进,但仍很复杂,且要求 使用催化剂 镍,对工艺条件提出了新地要求.化 学合成法使用地化学试剂在产品中会有不同程度地残 留 作为一种药或功能食品,对纯度有较高地要 求,而且大量化学试剂地使用会造成环境污染,从而 限制了产品质量及使用范围. 酶促合成法 酶促合成法生产 是以 及谷氨酸作原料,

图 酶法合成 流程图 ※专题论述 食 科 品 学 , . , .

菌株 平均生产能力由 提高到 . 孙智杰等 在谷氨酸棒杆菌() 中 表 达增 强 摄 氧 地 透 明 颤 菌 血 红 蛋白基因 []

合成需要过量铵之间地矛盾,在谷氨酸棒杆菌突变 株 中利用 酶地表达特性,设计了在线氮饥饿处 理地发酵过程;在限制初始氮源浓度地条件下,菌体在 生长后期自然进入氮饥饿状态 酶表达量增加,此 后再提供充足地铵盐,提高 地合成能力,结果使 地产量提高了 ,达到 ,菌体内谷氨酰 胺合成酶活性提高了 倍以上.李春等[]提出了原位氮 饥饿与铵盐梯度补加协同调控策略,提高了谷氨酰胺地 产量,最高产量可达 ,比原位氮饥饿工艺提高了 近 ,比未经过氮饥饿处理地旧工艺提高了近 , 达到 . 生物合成代谢调控

( ),以此提高细胞 地摄氧能力及能量地供给水平,结果在溶氧浓度只有 地条件下,重组菌比野生菌细胞干重提高了 倍, 达到了 ,谷氨酸地生产能力提高了 倍,达到了 , 地生产能力提高了倍, 达到了. 等 [ ] 从丙酮丁醇梭杆菌( )中克隆合成酶地编码基因, 构 建 重组质粒,导入 中进行克隆表 达,并研究了 合成酶地表达调控,结果发现 合成酶不受腺嘌呤共价修饰调控,重组菌地生长速度是 野生菌地 . 倍 等 [ ] 从腐臭假单胞菌 ( )中克隆谷氨酰胺合成酶基因 ,导入大肠杆菌中进行克隆表达,其表达量是 中地 倍.上述基础工作,为 构建工程菌大规模工业化生产 奠定了一定基础. 发酵工艺 培养基 等[] 研究了 浓度和延胡索酸对产黄菌属 ( )生产地影响, 结果发现 延胡索酸是 生产地关键影响因子;高浓度

图 发酵生产相关地生物反应及其关键酶

生物合成是以谷氨酸()和 为底 物, 在谷氨酰胺合成酶( , )地催 化下合成地 生物合成在细胞内是一个动态平衡 地过程,除了受到谷氨酰胺合成酶()调控外,还受到 谷氨酸脱氢酶( ),谷氨 酸合酶( , )地调控(图)[]. 因 此,代谢调控生物合成 ,须建立一套协同调控策 略,促进谷氨酰胺合成酶( ) 活性,抑制谷氨酸合酶 () 活性,抑制 地降解,从而过量合成 .

生物合成途径中关键酶地调控 等[ ] 在谷氨酸棒杆菌( )中研究了 浓度对 活性地影响,结果发现 浓度从 增加至 时 活性维持在 蛋白,没有发 生变化,

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但当 浓度大于 时 活性小于 地 ,即分别低于 蛋白, 蛋白;并且发现谷氨酸脱氢酶酶促反应是谷氨 酸棒杆菌摄取 地第一步反应.此研究结果为梯度 补氮生产 提供了理论基础. 等[ ] 考察了碳源和氮源对谷氨酸棒杆菌 ( ) 中 和 活性地影响,结果发现在碳源充足,氮源缺乏 地条件下 和 活性分别提高了 倍和 倍; 在碳源和氮源都缺乏地情况下 活性下降了 倍,

(～)有利于 地生产,但是当 浓度大 于 时又会抑制 地生产;最终得出当 浓 度为 ～,延胡索酸浓度为 时 生 物合成达到最大值 . 等[ ] 考察了 对金黄色葡萄球菌 ( )生产 地影响,结果发现 添加 地 地含量提高了 ,达 到 干细胞;添加 地含 量提高了 ,达到 干细胞. 湖北工业大学吴思方等[] 研究了氮源种类和浓度, 金属离子 等对 生产地影响,得出最佳发 酵培养基为:葡萄糖 ,氯化铵 ,玉米浆 . , 磷酸氢二钾 ,磷酸二氢钾 ,硫酸镁 , 尿素 ,硫酸亚铁 ,硫酸锰 , 硫酸锌 , , 结果使菌株 地 生产能力平均达 ,最高达 ,这 是目前文献报道地最高产量. 发酵控制方式 因为生物合成是在谷氨酰胺合成酶(

)催化下进行地,所以发酵法生产 地关键在于调控 酶活性文档收集自网络，仅用于个人学习 微生物发酵法是 地主要生产方法,生产国主 要是日本,韩国也有少量生产 年日本用发酵法 生产 地年产量达 年上升到 年则上升到 ,并有逐年递增地趋势.全世界 生产量逐年递增,在 年为 年为 , 目前年产量约为. 我国已有不少企业研究发 酵生产工艺,但只是在实验室小试或中试规模中生产 .由于发酵法生产 国外仅日本等几个国家生 产,所以国际市场对我国 出口需求迫切,预计年 出口量将迅速达到 . 对于我们这样一个 亿人口地大国 等药用 氨基酸需求量很大,有巨大地潜在市场,目前我国药 用 依靠进口且价格昂贵.预计国内 需求可达 吨 年,现在国际市场上 价格大约 万元左 右 吨 地生产成本大约为谷氨酸地 ～ 倍,产 值达到 亿人民币,利税可达到 亿元人民币.因此, 发酵法大规模生产 将满足国内地市场需求,推动 我国氨基酸发酵工业地发展,同时,产品还可出口创 汇进入国际市场分离纯化 发酵过程中地主要副产物是谷氨酸,而

和谷氨酸两者分子结构和化学性质相近,分离困难,并 且 不稳定,分离过程中在酸性条件下容易转化成 谷氨酸.国外 年代报道 提取收率为 ,近 来有专利报道实验室提取收率达 以上[ ] . 经典提取方法 经典提取方法有浓缩结晶法,冰析法和双柱法

(阴阳离子交换树脂组合法).用离子交换法分离提取 ,可将发酵液调至酸性,在酸性条件下使 成为 阳离子,用强酸性阳离子交换树脂吸附;也可将发酵液 调至中性附近,使其成为阴离子,用强碱性阴离子交换 树脂进行交换吸附;还可以将阳离子和阴离子交替使用. 分离纯化地最新进展 新型过滤技术,过滤与离子交换耦联技术及相关设

为提高发酵法生产 产量,国内外学者进行了 大量研究工作:吴思方等[] 采用随机诱变定向

筛选地育 种技术,并对发酵工艺进行了优化,使 产量达到 . ,这是目前文献报道 产量地最高值; []对生物合成特性及其调控机制进行了深 入研究,建立了相关地耦联发酵策略,使 生物合

备地开发应用,使 分离提取收率,纯度得到了大 幅度提高,并最终分离纯化出了符合药用标准地 .文档收集自网络，仅用于个人学习 3 / 3