HZ27抑制786—O 细胞的迁移实验研究 - 图文

肾癌细胞扩大触碰到静脉，沿着毛细血管、肾内部静脉延伸到肾静脉，它在静脉中形成瘤栓，从而可以转移到静脉进入右心房之中，之后从心房中运用血运转移扩散到骨骼，肺以及其他器官。综上所述：肾癌转移部位有骨，肝，淋巴结，肺等。对于早期肾癌经过手术治疗治愈后复发率较低，平均百分之二十左右，因此这类患者应该多注意复诊；经调查中期或晚期的肾癌在治愈之后复发率比较高，占到一半以上比例，因此这类患者应每隔三个月去医院复诊一次，及时吃医生开的药，注意均衡营养等。

致使肾癌发病的原因多种多样，至今尚未完全了解。其中吸烟、喝酒、高血压、肥胖以及遗传等都是肾癌发病的病因。下面就抽烟、激素和输血三种病因对肾癌发病进行分析。Tavani 等[4]对1989到1991年间的包括中国，美国等国家的部分癌症病人进行调查，吸烟者较容易发生肾癌，他们患上肾癌的相对危险因素(RR)=2。大多数报告显示吸烟导致人们患上肾癌的原因是烟草，大多数的烟草是可以致癌的，上述报道中男性肾癌患者多于女性最主要的原因也是男性吸烟人数比女性多。也许人们不知道有很多激素在人体中是可以引发癌症的，比如说仓鼠用己烯雌酚可形成肾皮质癌，人们可以从食物中获取钙元素减少肾癌发生的概率。令人难以理解的便是输血有可能导致肾癌，虽然这个病因有待肯定，但是瑞典有关报告出21例的肾癌患者，其中曾有过输血历史的人发生肾癌的危险性提高了百分之二十。Prineas等[5]对美国多位妇女进行了多变量统计分析, 有输血史在1993年时随访38例肾癌患者五年后RR=2.5，但在八年之后RR=1.5，而不能肯定是否曾经有输血过的患者RR却更高。所以输血这个病因还有待确定。

肾细胞癌常采取手术切割法治疗。它是一种将原发肿瘤及它转移灶部位完全切除的方法，目前较适用于肾癌中早期患者，对治疗肾癌有着至关重要的作用。近年来，肾细胞癌治疗方法的研究有了一定的进展。其中数免疫治疗肾癌，化学药物治疗肾癌的研究较为突出。由于肾癌细胞具有强大的免疫原性，它可以诱使宿主细胞产生免疫反应，增强患者的机体免疫能力，从而帮助患者缓和肾癌对身体的影响，以抑制肾癌细胞的转移。而使用化学药物治疗肾癌则是采用例如氮芥类，铂类，抗叶酸抑制剂等细胞毒药物来治疗肾癌。研究表明，将细胞毒药物联合使用，比如采用长春花碱与其他药物联合使用治疗肾癌的效果高于细胞毒药物的单一使用，但其毒性较高，不值得提倡。

本文研究的是HZ27抑制肾癌786—O细胞的迁移。肾癌786—O的相关蛋白Rac介导肿瘤转移的研究有很多。Itoh 等[6]研究员曾运用了实时对单细胞进行观察的单分子技术研究了 Rac蛋白对细胞移动的影响, 由此观察到在移动细胞里对于Rac的探测定位正不断的发生着改变，而且Rac在细胞膜前面不断聚集, 当细胞改变移动方向时, Rac1的表达就迅速地减少。这个实验研究表明它与细胞转移是有一定联系的。以下便谈谈关于它介导肿瘤转移的机制：前文中已描述肿瘤转移是原发肿瘤不断长大扩张到其他部位的过程。实验研究发现，Rac在多种人类常得的肿瘤中呈现高表达现象，

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它对于细胞骨架结构的调节有一定辅助作用，当某些例如是表皮生长因子等生长因子对细胞膜相应受体有作用时，它便会活化以致调节纤维细胞形成片层伪足(与细胞运动能力有关)[7]。而形成片层伪足的事件也就是Rac介导肿瘤转移的早期研究过程[8]。吴明富等[9]的研究报告证实, Rac1 在人肿瘤转移中有关键影响。综上所述，研究某种化合物药物以抑制Rac蛋白的作用，从而阻止它介导肿瘤转移是一种必然趋势。在本次试验中采用的化合物是HZ27，前期实验中已经证明了这种化合物可以抑制肿瘤细胞的增殖，控制它的增长速度，但是肿瘤最大的危害就是它是否会发生转移，即这种药物是否可以控制恶性肿瘤。那么它是否对于肿瘤细胞迁移有抑制作用呢？这还是一个有待探究的问题，值得深思。药物抑制肿瘤细胞迁移是一种复杂的过程，需要探究实验得出结论，以下通过免疫印迹法与Transwell试验等考察方法来进行探究。

2 实验部分

2.1 实验仪器及试剂

实验仪器：无菌培养皿，培养瓶，37℃，5%二氧化碳培养箱，超净工作台，显微镜，镊子，离

心机，巴氏吸管，酒精灯，Transwell小室，棉签，电泳仪，蛋白检测试剂盒，Odyssey 红外荧光成像仪

实验试剂：肾癌786—O细胞株，75%酒精，PBS溶液，胰酶，10％的胎牛血清RPMI1640培养液，33%的醋酸,结晶紫，甲醛，5%的脱脂奶粉,抗Rac和GAPDH抗体 2.2肾癌786—O细胞的培养实验

在无菌培养皿中迅速加入切除所得的肾癌周围的新鲜的组织样本，接种于培养瓶中，将培养瓶

带入实验室放入37摄氏度，体积分数为5％的二氧化碳,95%饱和湿度的培养箱内。打开超净工作台的紫外灯照射20分钟，关闭灯开关，打开仪器的排风系统，戴上消毒手套，使用在酒精灯上消过毒的镊子夹取使用百分之七十五的酒精溶液浸过的棉球反复擦拭操作台桌面。从冰箱中取出培养液与培养瓶以及消毒滴管放入超净工作台开始操作。将用酒精灯消毒过的培养瓶中的液体倒出，用巴氏吸管滴入PBS液并对培养瓶的底表面反复吹打清洗，吸取10ml液体，将其在1000转每分钟的离心机中离心5分钟，弃去上清液，在培养瓶中加入百分之零点二十五的胰酶对其消化约2分钟，在离心机1500转每分钟离心5分钟，弃去上清液，将它悬于含有10％的胎牛血清RPMI1640培养液中，于37摄氏度，体积分数为5％的二氧化碳培养箱中培养。隔24个小时在显微镜下对细胞生长情况进行观察和记录。

2.3肾癌786—O细胞的传代实验

如上所述，在消毒灭菌之后进行实验操作。将PBS溶液，培养液等放进工作台中，取出铺满底

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部的肾癌786—O细胞，先在显微镜下观察它的生长状况，当786—O细胞形状由梭形转变成圆形以后，加入百分之十的100μg/mL青霉素和100μg/mL链霉素胎牛血清高糖RPMI1640培养液2ml终止消化，用巴氏吸管轻吹打培养瓶底部待细胞脱落后将细胞混悬液移入10ml离心管，放入离心机中在1500转每分钟下离心5min，丢掉上清溶液，加入PBS溶液漂洗一次，并将溶液重新悬浮于刚才配好的高糖RPMI1640含血清培养基中，于37摄氏度，体积分数为5％的二氧化碳培养箱中培养。隔24个小时在显微镜下对细胞生长情况进行观察和记录。两天传代一次，传代三次。

2.4肾癌786—O细胞的Transwell迁移实验

用五十毫克每升的人工基底膜基质经过1:5倍的稀释得到的液体覆盖在Transwell小室底部膜的

上表面，在室内温度下使其完全干燥。在Transwell小试的小孔当中滴入吸取到的100μL的无血清高糖RPMI1640DMEM培养液，在三十七摄氏度下放置30分钟左右。然后我们在上室的聚碳酸酯膜的上方加入已经稀释过的一微升中含有3.9微克的肾癌786—O细胞培养液30μL，在37℃下把它放置30min，以便于将人工基底膜基质聚合生成凝胶[10]。使用0.25％的胰酶消化细胞消化约2分钟，停止消化后在1500转每分钟下离心弃去培养液，之后用PBS溶液清洗洗2次，用无血清培养基重悬，并将细胞密度调整到5×10^5每毫升，吸取100微升的细胞悬液到Trallwell迁移上室中，在24孔板下室中滴进HZ27溶液，分别为1.67μM低剂量药物，3.3μM中剂量药物，10μM高剂量药物，另设一组阴性对照组（不加药物，只加培养液，其他相同），常温常压下培养48个小时，用干净的棉签轻轻涂掉孔板中的上室内的细胞，加入含量体积分数为百分之四的多聚甲醛，以至于固定三十分钟后，使用百分之零点一的结晶紫溶液染色5分钟，用棉签将结晶紫擦拭，运用正置显微镜进行观察以及拍照并记录,然后使用33%的醋酸将结晶紫洗脱，分别测得洗脱液的OD值。平行重复三次试验。

2.5免疫印迹法检测肾癌786—O细胞中蛋白Rac表达实验

将肾癌786—O细胞经过靶向中剂量药物转染四十八小时后，被RIPA裂解液中的蛋白酶抑制

剂所裂解，从而将细胞中的蛋白质给提取出来。蛋白质的浓度我们可以通过使用BCA蛋白检测试剂盒测定。使用6％的十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳进行操作，以三十微克每孔的上样数量上样，把被电泳分离得到的蛋白电转移至硝酸纤维素膜上面，用百分含量为五的脱脂奶粉的TBST隔绝空气室温下放置一小时，向其中加入稀释了一千倍的抗Rac和GAPDH抗体，之后分别滴加进稀释了一千倍的DyLight800对这两种物质进行荧光二抗标记[11]，在25摄氏度下反应约两小时。进行洗膜操作并使用 Odyssey 红外荧光成像仪对图像进行扫描，最后分析结果时运用Photoshop软件[12]。

3 结果与讨论

3.1 Rac转染786—O细胞

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Rac蛋白可以转染肾癌786—O细胞这在实验过程中是十分明显可以观察到的，如图一显示的

图片，实验观察中我们在荧光显微镜下可以观察到转染的细胞呈现绿光，转染的概率非常高。

3.2 细胞活性

从实验结果得到的照片中可知：药物对Rac蛋白有所抑制后，它转染抑制了Rac蛋白也在同一

时间控制了肾癌786—O细胞的生长和繁殖。且药物剂量越高，对Rac蛋白的抑制力越强，对于细胞迁移抑制力越强。

3.3 Transwell迁移试验 3.3.1细胞迁移定性分析

以下照片分别记录了使用1.67μM低剂量HZ27药物，3.3μM中剂量HZ27药物，10 μM高剂量HZ27药物作用于细胞和阴性对照在Transwell小试下室中迁移得到的786—O细胞数目。可知高剂量可有效抑制肾癌786—O细胞转移，随着HZ27药物剂量越高，肾癌786—O细胞的转移能力越弱。

阴性对照（Negative control group） 1.67 μM低剂量（Low dose 1.67 μM）

3.3μM中剂量(The dose 3.3 μM） 10μM高剂量（High dose 10 μM）

图1：不同浓度的HZ27药物对肾癌786—O细胞迁移影响比较（×200）

Fig.1 Different concentration of HZ27 drug effects on kidney cancer cell migratin 786-O(×200)

3.3.2细胞迁移定量分析

上述图片我们可以定性地观察到药物HZ27对肾癌786—O细胞迁移影响，下面我们通过对药物OD值的比较定性地比较不同浓度药物HZ27对肾癌786—O细胞迁移影响。

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