细胞工程 - 要点、思考题、补充题详解

第一章 绪论 小结： 一、生物工程

定义：一般称为生物技术，是以生命科学为基础，利用生物体系和工程学原理生产生物制品和创造新品种

的一门综合技术。 二、细胞工程

定义：应用细胞生物学和分子生物学的方法，通过类似于工程学的步骤，在细胞整体水平或细胞器水品上，

按照人们的意愿来改变细胞内的遗传物质以获得新型生物或特种细胞产品的一门综合性科学技术。 重要应用：（1）动植物快速繁殖； （2）品种改良与新品种培育； （3）细胞工程生物制品； （4）组织工程；

（5）动物胚胎工程快速繁殖优良、濒危品种； （6）医学器官修复或移植的组织工程； （7）用于能源开发、环保；

（8）转基因动植物的生物反应器工程； 第二章 细胞工程基础 小结： 一、细胞生物学基础

细胞分化：是指细胞在形态、结构和功能上发生差异的过程，包括时间上和空间上的分化。

细胞全能性：是指分化细胞保留着全部的核基因组，具有生物个体生长、发育所需要的全部遗传信息，具

有发育成完整个体的潜能。

二、分子生物学基础

转基因技术步骤：（1）目的基因的获取；（2）构建重组DNA；

（3）重组DNA引入受体细胞；（4）表达目的基因受体细胞的挑选； 三、普通生物学基础

生殖与发育：有性生殖：是两个配子融合为一，成为合子或受精卵，再发育成为新一代个体的生殖方式。 第三章 植物组织与细胞培养 小结：

一、植物组织培养（概念、原理、培养条件、常用仪器、步骤、应用、人工种子等）

概念：是指将植物组织、器官、细胞、胚胎、原生质体等在适当培养条件下诱导产生愈伤组织或长成完整

植株的技术。

原理：利用细胞全能性。

培养条件：（1）处于离体状态的植物活细胞；

（2）在一定的营养物质、激素和其他外界条件； 常用仪器：解剖刀，解剖剪，解剖针，镊子，高压灭菌锅，锥形瓶。

步骤：（1）培养材料的采集：理论上全能植物细胞有3类：A、受精卵B、根尖、茎尖、叶、花、等分生

组织细胞；C、雌雄配子及单倍体细胞，如花药、花粉粒等；

（2）培养材料的消毒：材料先用自来水冲洗干净→用蒸馏水冲洗（超净台）→无菌水冲洗→无菌滤

纸吸干水→已消毒解剖刀切成小块→70%酒精浸泡30-60S→移入漂白粉饱和液或0.01%升汞消毒10min左右→无菌水冲洗→无菌滤纸吸干水；

（3）制备外植体：用消毒工具将表面消毒的材料做些处理（芽除鳞片，嫩枝除外皮，种子去种皮，

去胚乳等。叶片直接切成0.2-0.5cm）；

（4）接种和培养：接种→封口→置培养室培养（25-28℃，温度70%-80%，光强3000-4000lx，时长

10-16h）→继代培养→分化培养（一般在基本培养基中加入一定配比生长素与细胞分裂素，无菌操作）；

（5）诱导生根：将生成不定芽的材料转到生根培养基上诱导生根（一般在培养基中加入生长素，无

菌操作）；

（6）练苗、移栽：幼苗根长到一定长度→瓶口打开，自然光照3天→移出幼苗→自来水冲洗根上培

养基→移入基质（珍珠岩、蛭石）→清水喷洒练苗1d→移入大田； 应用：（1）无性系快速繁殖；（2）获得脱毒苗；

（3）选育新品种：a、突变育种；b、原生质体融合和细胞杂交； c、花药、花粉培养和单倍体植株；

（4）有助于遗传、生理生化、病理研究；（5）保存种质资源；（6）产业化生产；

人工种子：是指将植物离体培养的胚状体或芽包裹在含有养分和保护功能的人工胚乳和人工种皮中的类似

种子的颗粒。

二、植物细胞培养（概念、理论基础、方法分类、培养条件、常用仪器、制备方法、培养方法、保存方法、应用、固定化培养及方法等）

概念：在离体条件下，将分离的植物细胞通过继代培养增殖获得大量细胞群体的一种技术。 理论基础：植物组织培养。

方法分类：（1）根据培养对象分类：单细胞培养；单倍体培养；原生质体培养； （2）按照培养系统分类：悬浮培养；液体培养；固体培养；固定化培养； 培养条件：营养盐、前体和调节因子、光照、温度、搅拌与混合、通气、PH。 常用仪器：机械搅拌式生物反应器、气升式生物反应器、鼓泡式生物反应器。 培养方法：（1）分批培养；（2）流加式培养；（3）半连续培养；（4）连续培养； 保存方法：（1）继代培养保存法；（2）低温保存法；（3）冰冻保存；

应用：主要用于生产色素、药物，食品、酶、精细化工产品等次生代谢物为目的的大规模细胞培养技术。 固定化培养：将细胞固定在载体上，使活细胞固定在一定的空间范围进行生命活动的技术。 固定化培养方法：（1）吸附法；（2）包埋法；（3）结合法；（4）交联法； 三、两相培养技术（概念、优点、条件）

概念：是在培养体系中加入有机溶剂或者具有吸附作用的多聚化合物。

优点：不仅减少了产物的反馈抑制作用，从而提高产物含量，而且可以通过有机相的不断回收及循环使用，

实现培养的连续化。

条件：（1）添加的有机物或多聚化合物对植物细胞无毒，不影响细胞的生长与产物的合成；

（2）产物能较容易地溶解于有机相中或被多聚化合物吸附； （3）两相之间分离容易；

（4）有机物或多聚化合物不能吸收培养基中的有效成分； 四、植物原生质体培养（概念、用途、制备、培养、再生植株等） 概念：是去除细胞壁后裸露的球形细胞。 用途：（1）提供相关生理生化研究的材料；

（2）用作研究基因调控和表达、遗传工程研究的材料； （3）进行原生质体融合，改变遗传物质，建立杂交品种； （4）用于研究染色体行为、基因定位等；

（5）用于细胞器的分离，或进行相关细胞器的遗传试验；

制备：（1）机械法：材料放入高渗溶液中，发生质壁分离，最后原生质体收缩成球形完全与细胞壁脱离，

此时用剪刀剪碎组织、切碎细胞壁，使原生质体释放出来。

（2）酶解法：取材消毒→酶解制备→原生质体收集。 培养：（1）液体培养法；（2）固体平板法；（3）双层培养法； 再生植株：（1）愈伤组织诱导；（2）诱导胚状体； 思考题：

1、什么是植物组织培养和细胞培养？有怎样的区别？

组织培养：从生物体内取出组织或细胞，模拟机体内生理条件，在体外进行培养，使之生存或生长成组织

的技术。植物组织培养主要是植物无性脱毒快速繁殖技术。

细胞培养：使动植物细胞在体外条件下存活或生长的技术，不再形成组织。植物细胞培养主要是以生产植

物次生代谢产物为目的的大规模细胞培养技术。

2、举例说明植物组织培养的快速繁殖技术的步骤和方法。

1.无菌母株的建立：在无菌条件下，用于试管内继代增殖的植物材料； 方法：取嫩枝，冲洗，消毒，切割带一两芽的茎段，接种，诱导不定芽形成。

2.不定芽（腋芽、愈伤组织、胚状体）增殖：将获得的无菌母株，在无菌条件下进行再次切割，继代培养，使在芽眼处形成丛生芽；

3.生根培养生根培养基：提高生长素水平（NAA0.1-0.3），降低细胞分裂素水平(BA0.1-0);改用1/2MS(大量元素减半)或1/4MS (大量元素1/4)

4.炼苗：日光锻炼：通过晒苗，恢复试管苗叶绿体光合作用功能；2-3天 湿度锻炼：出管前一周打开瓶湿度锻炼

5.移植：将小苗基部培养基冲洗干净，移栽于基质中。注意保湿，移植10 d 内湿度为80-90%. 3、植物组织培养的主要意义有哪些？最新进展如何？ 意义：（1）无性系快速繁殖；（2）获得脱毒苗；

（3）选育新品种：a、突变育种；b、原生质体融合和细胞杂交； c、花药、花粉培养和单倍体植株；

（4）有助于遗传、生理生化、病理研究；（5）保存种质资源；（6）产业化生产； 进展：（1）花卉种苗产业化生产；（2）蔬菜、水果种苗脱毒；（3）瓜果组培苗产业化生产； 4、植物细胞培养最主要的用途体现在哪里？举例说明。 主要用途：原生质体培养再生植株。 举例：经济海藻—江蓠

5、植物细胞培养的营养成分主要包括哪些？

（1）无机盐：硝酸盐、铵盐，钾、磷、镁、钙、硫元素； （2）碳源：蔗糖或葡萄糖，果糖，碳水化合物； （3）植物生长激素：生长素和分裂素，如吲哚乙酸； （4）有机氮源：蛋白质水解产物、谷氨酰胺或氨基酸混合物；

（5）有机酸：丙酮酸或三羧酸循环中间产物，如柠檬酸、琥珀酸、苹果酸。 （6）复合物质：生长调节剂，包括酵母抽提液、麦芽抽提液、椰子汁和水果汁。 6、什么是两相培养技术？有什么优点？

两相培养技术：是在培养体系中加入有机溶剂或者具有吸附作用的多聚化合物。

优点：不仅减少了产物的反馈抑制作用，从而提高产物含量，而且可以通过有机相的不断回收及循环使用，

实现培养的连续化。

7、简述原生质体培养再生完整植株的技术路线。

（1）原生质体材料来源：采集江蓠，消毒海水洗刷藻体。取侧生嫩枝切成1-2cm长的切段，放入培养皿中，

加MES培养液培养，温度19-20度，光强2000-2500lx，培养一个月左右，取再生的嫩枝作为分离原生质体的材料；

（2）原生质体分离纯化：分离：机械法或酶解法；

纯化：过滤-离心法；漂浮法；沉降法和漂浮法结合；最终得到原生质体悬浮液；

（3）再生植株培育：接种原生质体于装有EMS培养基的培养皿中，同时放置同种江蓠小块进行看护培养。

逐渐增强光照，温度20度，当原生质体发育成的愈伤组织分化出芽后，将其移植进大烧杯中用液体EMS培养基通气培养，光强增至2800-3000lx，培养液每周更换一次。芽球进一步发育生长形成苗，一月左右发育成完整植株。

补充思考题：

1、为什么茎尖分生组织培养能够获得脱病毒植株？

因为茎尖分生组织没有分化出维管组织，病毒难以感染到这个部位。 2、培养基、外植体、玻璃器皿、金属用具等一般选择怎样的灭菌方法？ （1）培养基的灭菌：高压蒸汽灭菌（湿热灭菌法） （2）外植体的灭菌：酒精、无菌水冲洗；

（3）玻璃器皿的灭菌：湿热灭菌法或干热灭菌法。 （4）金用具的灭菌：干热灭菌或火焰灭菌法。 3、目前用作原生质体分离的材料有哪些？

（1）各种植物的叶片、根尖，也有来自于花粉，尤其是适合制备单倍体的原生质体； （2）从组织培养产生的愈伤组织中获得；

4、哪些类型的外植体适宜用作建立悬浮细胞系起始培养物？ 幼胚；胚轴；子叶。

5、一个好的植物悬浮细胞系有哪些特征？ （1）悬浮细胞分散性良好，细胞团较小；

（2）细胞均一性好，在倒置显微镜下观察，细胞形状和细胞团大小大致相同； （3）细胞生长迅速，一般2-3天甚至更短时间可增加一倍； 6、人工种子利用有何优点？ （1）便于运输和储存，快速繁殖；

（2）人工胚乳可根据不同植物的要求配置，通过加入植物激素、有益微生物或抗病、抗虫成分，使人工种子优越于天然种子，更利于种子生长；

（3）可以固定杂种优势，可保存珍贵稀有植物品种；

（4）利于快速繁殖，生产效率高；（5）可作为植物基因工程和遗传工程的桥梁； 第四章 动物细胞与组织培养 小结：

一、动物细胞组织培养（概念、原理、培养条件、常用仪器、步骤、原代培养、传代培养、贴壁培养、传统培养方法、大规模培养方法、应用、保存方法等）

概念：是模拟动物体内的生理环境使细胞分裂增殖的一种技术。

常用仪器：培养瓶、培养皿、多孔塑料培养板、二氧化碳培养箱、相差显微镜； 培养条件：温度、PH、气体、营养； 贴壁培养：（1）将培养物分散成细胞悬液；

（2）过滤、离心、纯化、漂洗、接种（玻璃、改性塑料、金属、微载体）；

（3）二氧化碳培养箱培养；

二、组织工程（概念、组织培养、应用等） 现组织修复或器官再生的一门技术。

组织培养：（1）上皮组织的体外培养（2）肌肉组织的体外培养（3）神经组织的体外培养 三、干细胞（概念、特性、分类、ES细胞概念、培养方法及步骤、意义等） 概念：是一类具有自我更新和分化潜能的细胞。

特性：干细胞具有较高的端粒酶活性，因此具有较强的增值能力。（1）缓慢性：干细胞的增值速度一般比较慢；（2）自稳性：干细胞会自我更新维持自身数目的恒定。 分类：（1）单能干细胞；（2）多能干细胞；（3）全能干细胞；

ES细胞概念：是从着床前胚胎内细胞团或原始生殖细胞经体外分化抑制培养分离的一种全能性细胞。 培养方法及步骤：（1）内细胞团获得：手术法获得动物着床前胚胎，用毛细吸管等工具在显微镜下剥离胚

胎获得内细胞团；

组织工程：是利用生命科学、医学、工程学原理与技术，单独或组合地利用细胞、生物材料、细胞因子实