现代生物学实验技术实验报告

3、冰冻蚀刻技术

冰冻断裂与蚀刻复型：主要用来观察膜断裂面的蛋

白质颗粒和膜表面结构。 4、电镜三维重构技术

电子显微术、电子衍射与计算机图象处理相结合而形成的具有重要应用前景的一门新技术。

电镜三维重构技术与X-射线晶体衍射技术及核磁共振分析技术相结合，是当前结构生物学（主要研究生物大分子空间结构及其相互关系）的主要实验手段。

实验三、胶体金的制备

一、 实验原理

氯金酸(HAuCl4)在还原剂作用下，可聚合成一定大小

的金颗粒，形成带负电的疏水胶溶液。由于静电作用而成为稳定的胶体状态，故称胶体金。胶体金颗粒由一个基础金核（原子金Au）及包围在外的双离子层构成，紧连在金核表面的是内层负离子（AuC12－），外层离子层H+则分散在胶体间溶液中，以维持胶体金游离于溶胶间的悬液状态。

胶体金标记，实质上是蛋白质等高分子被吸附到胶体

金颗粒表面的包被过程。吸附机理可能是胶体金颗粒表面负电荷，与蛋白质的正电荷基团因静电吸附而形成牢固结合。用还原法可以方便地从氯金酸制备各种不同粒径、也就是不同颜色的胶体金颗粒。

免疫金标记技术(Immunogold labelling techique) 主要利用了金颗粒具有高电子密度的特性，在金标蛋白结合处，在显微镜下可见黑褐色颗粒，当这些标记物在相应的配体处大量聚集时，肉眼可见红色或粉红色斑点，因而用于定性或半定量的快速免疫检测方法中，这一反应也可以通过银颗粒的沉积被放大，称之为免疫金银染色。

二、 实验步骤

? 柠檬酸三钠法

0.01%氯金酸（HAuCl4)水溶液100ml加热至沸腾，加4ml

1%柠檬酸三钠水溶液，出现酒红色。 ? 金颗粒大小与柠檬酸三钠的关系

柠檬酸三钠（ml) 4 1.5 1.0 0.75 金颗粒的直径（nm) 15 30 50 60 胶体金与标记蛋白的配比

? 胶体金pH的调节：用0.1mol K2CO3调到pH9.0 ? 取7支2ml离心管分别加入1ml胶体金

? 再向每支管中加入1ml不同浓度的牛血清白蛋白 ? 混合均匀后分别加入0.1ml10%NaCl

? 混合均匀后按照下图观察颜色的变化 ? 确定出包裹胶体金蛋白的量 胶体金与标记蛋白的比例

40 35 30 25 20 15 10

蛋白含量μg（牛血清白蛋白）

三、 注意事项

1、 配制胶体金溶液的pH以中性（pH7.2）较好。 2、 氯金酸的质量要求上乘，杂质少。最好是进口的。 3、 玻璃器皿必须彻底清洗，最好是经过硅化处理的玻

璃器皿，或用第一次配制的胶体金稳定的玻璃器皿，再用双馏水冲洗后使用。否则影响生物大分子与金颗粒结合和活化后金颗粒的稳定性，不能获得预期大小的金颗粒。