当前位置：首页 > 自动生化分析技术教材
吸光度下降的负向连续监测法。连续监测法也可用于测定呈线性反应的代谢物浓度，一般是采用酶法测定的代谢 物。结果计算公式：酶活性(U／L)=ΔAu／min×K；代谢物浓度Cu=ΔAu／min×K。 酶活性测定公式中的系数K包括理论K值、实测K值和校准K值三种。
1．理论K值 若某酶活性测定没有可用的校准品，则计算酶活性的公式由酶活性的国际单位定义推算得出，即
式中ε为指示物质的摩尔消光系数，Vt、Vs和b分别为反应液总体积、样本体积和比色杯光径，自动生化分析仪的b一般会自动校正为1。常用指示物质NADH(NADPH)和对硝基酚类等在一定条件下ε已经被测定获知，试剂说明书中均会提供，依此可计算出理论K值，作为分析参数输入到分析仪中。因为酶校准品的制备和保存困难，故早期几乎所有酶活性测定项目均没有校准品，因而多采用理论K值。
2．实测K值 ε因波长和温度的不同有所不同，故由试剂说明书提供的ε可能与实际所用分析仪所测不同，因而有必要获得用户所用分析仪的实际ε，再计算K值，此为实测K值。实测K值的测定较麻烦，而且需要适时测定。 3．校准K值 酶活性测定过程中的分析条件如温度、样本、试剂以及吸光度检测等可发生波动或偏差，如同时进行校准品测定，根据校准品计算校准K值：校准K值=(酶活性U／L)s／(ΔA／min)s。校准K值通常优于理论K值和实测K值，但其依赖于优质的酶校准品，现在已有越来越多公认的酶校准品用于实验室，如ALT、AST、CK、LDH、GGT、ALP、AMY等。酶校准品应具有溯源性，并与所用试剂相配套。 ’ 四、比浊法
比浊法(turbidimetric assay)是通过测定微粒性物质对光的散射或透射强度来测定物质的浓度，主要用于测定能形成悬浮体的颗粒物质。当光线通过一浑浊溶液时，悬浮的颗粒物质一方面选择性地吸收一部分光能，另一方面向各个方向散射了一部分光线，使透过溶液的光强度减弱。比浊法也采用终点法尤其是两点终点法进行检测。比浊法可分为化学比浊法和免疫比浊法。
1．化学比浊法 其基本原理是：待测物在一定条件下反应形成不可溶的微细沉淀(微粒)，这些微粒的存在使透过的光减弱，通过检测透光强度，计算出样本中物质的浓度，如采用三氯乙酸、磺基水杨酸法测定尿液、脑脊液中蛋白质。该法灵敏度高，但影响浊度的因素很多，重复性较差。
2．免疫比浊法 其基本原理是：抗原与抗体发生反应形成的可溶性免疫复合物，通过某种方法使其自液相析出，形成微粒，这些微粒具有对光的反射和折射能力，通过检测散射光或透射光的强度，计算样本中待测物的浓度(图5-7)。免疫比浊法根据测定的光线不同分为免疫散射比浊法(immjuno-scatter turbidimeter)、免疫透射比浊法(immuno-transmissionturbidimeter)，在自动生化分析仪上只能采用免疫透射比浊法，即在光源的光路方向测定透光强度，测定的光通量与待测物质的浓度成反比。该反应的待测物浓度与吸光度之间不成线性，需要做多点校准。免疫透射比浊法主要用于血清、脑脊液等体液中特种蛋白的测定，如．ApoAI、ApoB、前白蛋白(PA)、hs-CRP、βp2-MG，以及尿白蛋白(mAlb)等。
使免疫复合物形成微粒的方法有促聚剂和交联剂。在抗原抗体反应的溶液中加入非离子性亲水多聚体如聚乙二醇，能促进免疫复合物的形成。另外，将待测物质相对应的抗体包被在直径为15～60nm的聚苯乙烯胶乳颗粒上，使抗原抗体结合物的体积增大，浊度增高，透射光和散射光的强度变化更为显著，从而提高敏感性，这种方法称为胶乳增强免疫比浊法。
免疫透射比浊法抗原不能过量，如果样本中待测物质浓度过高，免疫复合物微粒将会变小，而且易发生解离，其浊度反而下降，因此免疫比浊法需要比较分析过程中后两个吸光度的差别，如果后一点比前一点吸光度低，则表示抗原已过剩，需要稀释样本后重测。
第三节启动生化分析仪的参数设置
分析参数是仪器工作的指令，自动生化分析仪在测定分析前，需要设置各项目的分析参数(analysis parameters)，如样本和试剂用量、温度、反应时间、测定波长、检测方法等。某些分析仪使用配套试剂时，其分析参数已经固定在程序中，用户不能更改甚至不可见，这些分析项目称为封闭通道，而允许用户修改或设定分析参数的分析项目称为开放通道。
分析仪的分析参数分为基本分析参数(也称通用分析参数)和特殊分析参数(或称质量保证参数)。 一、基本分析参数
1．项目名称 项目名称是测定项目标示符，常以项目的英文缩写来表示。
2．样本量与试剂量 分析仪设置的样本量、第一试剂和第二试剂量，有些还会有第三试剂量，需按照各种分析仪的可加样或试剂体积范围、反应液总体积范围以及试剂样本体积比来确定。各种分析仪的最小反应液总体积80～350ul不等，样本量和试剂量由样本体积分数(sample volume fraction，SVF)来决定。SVF是样本体积(Vs)与反应
总体积(Vt)的比值，即SVF=Vs／Vt。SVF越大，灵敏度越高，但线性范围越窄。因此要将SVF设定在一个合适的值，不宜随意修改，否则会影响检测灵敏度和检测上限。
3．试剂的选择 反应过程中一般加入一种或两种试剂，分别称为单试剂法和双试剂法。
(1)单试剂：把某种生化反应所需要的全部试剂科学地混合在一起，组合成一种试剂，检测时只需将样本加入试剂中混合，即可进行相应的生化反应，然后采用适当方法检测结果。
(2)双试剂：将某些生化检测项目所用到的试剂按照用途科学地分成两类，分别配成两种试剂(R1、R2)。通常加入R1后，可起到全部或部分消除某些内源干扰的作用，R2为启动样本中待测物质反应的试剂，两种试剂混合后才共同完成被检测项目的生化反应。
样本和R1加入时间通常固定在反应起始点，孵育一定的时间，在加入R2前测定吸光度A1(此即样本空白吸光度)，然后加入R2，混匀，反应时间根据分析方法是终点法或速率法进行设置。不同分析仪R2的加入时间有所不同，某些分析仪只有一个固定时问，有些分析仪则有两个时间点可选，可根据待测物的时间．吸光度曲线确定。
在终点法中，单试剂抗干扰能力差，会带来分析误差，而双试剂消除了样本的内源性干扰(脂浊、溶血、黄疸等)和比色杯等光路带来的影响，提高了分析的准确度。同时，R1、R2分开保存，提高了试剂的稳定性。 ’ 4．温度的选择 生化分析仪通常有37℃，部分还有3O℃和25℃，一般将温度设定在37℃。 5．分析方法选择 根据试剂说明书选择检验项目的分析方法为终点法或连续监测法。此外，相关的设置还包括：①终点法和连续监测法包括减试剂空白或不减试剂空白，多选择前者。色素原底物如发生自身水解，对反应体系产生的空白速率应在测定速率中减去，而某些内源性干扰引起的速率包含在待测物的速率中无法减掉，只能通过设置一定的延迟时间或恰当的主读数区间，加上双波长检测来尽量避免。②固定时间法需明确样本中干扰物的特性。另外，还需设定反应方向为正向反应还是负向反应。
6．测定时间选择 生化反应的时间是某个检测项目所特有的，而且因所选用的分析方法不同而异。
(1)终点法：测定时间的选择要充分考虑到干扰问题。一点终点法通常根据时间．吸光度曲线设在反应刚完成时，过早会由于反应未达到终点而使检测结果偏低，过晚易受到其他物质的干扰。两点终点法通常将加入R2前的时间点作为第一个测光点，第二个测光点的选择与一点终点法相同。
(2)连续监测法：需要设置延迟时间和监测时间。延迟时间(delay time)指在速率法中试剂与样本混匀开始到监测期第一个测光点之间的时间段。设定延迟时间是为了使比色杯中的混合溶液达到酶促反应所需的温度，使试剂中含有的工具酶充分激活，使内源性干扰物被消耗。延迟时间由被测物质浓度(或酶活性)、反应速度、酶促反应的级数和样本中干扰物质消除所需的时间决定。延迟期后酶促反应在过量底物存在的情况下以恒定的速度进行，此阶段为线性反应期，分析仪的监测时间(monitoring time)即选在此期，至少监测90～120秒之间的不少于4个测光点(3个△A)。 7．波长选择
(1)波长大小的选择：测定波长的选择要兼顾待测物和干扰物，使待测物在该波长下光吸收最大，同时使常见的干扰物在该波长下光吸收最小。其确定方法是以波长为横坐标、吸光度为纵坐标作吸收光谱曲线。试剂盒说明书会提供波长参数。大多数检验项目的分析原理不同，所生成的产物也不同，所以需要设定不同波长。试剂盒往往将一些通用化学反应(如Trinder反应、指示酶、指示试剂)与之偶联，使产物的检测能适应仪器提供的单色光。 (2)单波长和双波长的选择：除了对波长大小的选择，分析仪还要设置单波长法或双波长法。单波长法(single waVelength method)是用一个波长检测物质的光吸收强度的方法，当测定体系中只含有一种组分或混合溶液中待测物的吸收峰与其他共存物质的吸收峰无重叠时，可选择该方法。双波长法(dual wavelength method)是指当干扰物有较大吸收峰或溶液浑浊时会出现光散射和非特异性光吸收，从而影响检测结果的准确性，需要采用两个不同的波长即测量波长(又叫主波长，primary wavelength)和参比波长(又叫次波长，secondwavelength)同时测定。使用次波长的目的是：①消除噪声干扰，从光源到比色杯、单色器、检测器的整个光路系统中，均存在随时间发生变化的不稳定检测信号，即噪声。因为两种波长检测产生的噪声基本相同，所以能消除噪声干扰。②减少样本本身光吸收的干扰。当样本本身存在光吸收干扰如溶血、黄疸和脂浊时，采用双波长方式检测可部分消除这类干扰。⑧对浑浊溶液可减少杂散光影响。
主、次波长的选择有一定原则，主波长是被测物吸收峰所处的波长，应选择距被测物吸收峰最近处，尽量避开来自试剂光吸收等的干扰。次波长的选择原则是：使产物在主、次波长处的吸光度有较大差异，而干扰物在主、次波长处有尽可能相同的吸光度。 一、特殊分析参数的设置 1．试剂吸光度检查
(1)试剂空白吸光度：是检查试剂质量的指标之一。每种试剂本身有一定吸光度(AB)，需在分析仪上设定AB的
范围，超出时仪器会报警，提示试剂变质。如有些试剂久置后变浑浊，Trinder反应中酚类物质会逐渐氧化为醌类产物，使AB升高；另外，试剂中NADH可逐渐氧化为NAD+，其AB随时间延长而下降。
(2)试剂空白速率：试剂空白速率(rate of reagent blank)在反应温度下，某些试剂于检测过程的短时间内可能发生较为明显的自身分解等变化，使测定结果偏高或偏低，设置此参数便能在待测物反应的吸光度变化速率中减去试剂空白速率，从而消除或减少这类误差。如色素原底物在37℃分解产生黄色产物，使测定结果出现正误差。又如胆红素对碱性苦味酸速率法测定肌酐有负干扰，原因是：胆红素在检测波长505nm有较高吸光度，但在碱性环境中胆红素被氧化其吸光度降低，因而在反应过程所测的光吸收呈下降趋势。若在加入R1后一段时间内检测试剂空白速率，即为胆红素分解速率，加入R2后的反应速率为肌酐和胆红素共同反应速率，两者相减，便可消除胆红素的负干扰。
2．酶活性测定准确度的监测
(1)线性检查：用于连续监测法，设定一个非线性度对监测时间进行线性判断。通过将监测时间内的吸光度值进行线性回归，计算各点的方差，根据方差值的大小来判断该监测时间是否处于线性期。
(2)弹性速率设置：在酶活性测定中，当酶活性太高，在监测时间内已不呈线性反应时，有些仪器具有弹性速率功能可设置，即选择监测时间前的线性段吸光度值计算结果，使酶活性测定的线性范围得以扩大。
(3)底物消耗限值：在连续监测法的测定项目中，可设置化学反应后吸光度升高(正反应)或下降(负反应)的限值。超过此限值说明酶反应的底物消耗过多，已不足以维持底物的零级反应，则该检测结果不准确，仪器能自动提示。
3．样本性状监测 样本的溶血、脂浊、黄疸等会对测定结果产生干扰，根据各自的光谱吸收特性，用双波长测定样本在600nm／570nm、700nm／660nm和505nm／480nm．的吸光度比值来分别判断样本溶血、脂浊和黄疸程度，并可在检验报告单中显示这些信息。
4．线性范围的选择 只有当反应吸光度处于线性区间时，检测结果才与吸光度变化成正比，因此需设定恰当的线性范围。设置线性范围后，检测结果若超过此范围，分析仪将提示，且某些分析仪可自动将样本减量或自动稀释后重新测定。
第四节检测系统的校准和性能评价
测定一个检验项目除了涉及自动生化分析仪，还涉及仪器所使用的试剂、校准品、质控品和检测程序等，如有手工操作步骤，还应包括操作人员，这些要素组成的分析测定系统称为检测系统(testing system)。实验室在建好自己的检测系统后，以及在检测系统使用过程中，需定期进行校准，并对检测系统性能做出评价，在确保检验结果的准确性、精密度、灵敏度等符合要求后，才能用于临床标本的检测。 一、检测系统的校准
对于一个临床检验项目，如果所用检测系统中分析仪、试剂、校准品、质控品和检测程序中任何一个改变，都可能得到不同的检测结果。所以卫生部临床检验中心拟定的《临床实验室(定量测定)室内质控工作指南》中明确指出：对检测系统一定要进行校准，校准时要选择合适的(配套的)校准品；如有可能，校准品应能溯源到参考方法和(或)参考物质；对不同的分析项目要根据其特性确立各自的校准频率。
1．校准的定义 校准(calibration)也称定标，是指在规定条件下，为确定测量仪器或测量系统所指示的值、实物量具或参考物质所代表的值与相对应的由标准所复现的量值之间关系的一组操作。按美国临床实验室改进修正案(Clinical Laboratory ImprovementAmendment 88，CLIA88)可以简化校准的定义为：测试和调整分析仪器的输出，建立样本测量值(如吸光度)与样本实际浓度的相关关系的过程。
为了得到准确可靠的测定结果，并使测定结果在不同实验室之间具有可比性，必须建立标准的检测系统。很多仪器厂商为自己的生化分析仪提供配套的试剂、校准品和质控品，而且建立了完善的测定程序，但因为成本相对较高，目前国内大部分实验室使用的是自建的检测系统，必然会影响测定结果的准确性，阻碍了不同医院之间检验结果的互认。
2．校准方法 如果实验室采用的是标准检测系统，其校准品和校准方法由厂商提供。如果是自建的检测系统必须建立校准方法，包括：①选择合适的校准品及校准品的数量、类型和浓度。如有可能，校准品应追溯到参考方法或已知值的参考物质。②确定校准验证的频度。根据不同检测项目在检测系统中的稳定性不同而确定不同的校准频度，如每日校准、每周校准、每月校准、每两月校准，甚至每六个月进行一次校准等。一般要求至少半年校准一次，但如果检测系统更换了重要部件、进行了大的维护，或者改变了试剂的种类、批号(如果实验室能说明改变试剂批号并不影响结果，则可以不校准)，或质控反映出异常趋势或偏移，都需要及时校准。
生化分析仪的校准类型有单点校准、两点校准和多点校准。大多数检测项目的校准曲线呈直线且通过原点，用
单个浓度的校准液即可；若校准曲线呈直线但不通过原点，则需要用两个浓度的校准液做两点校准，当校准曲线不呈直线而为曲线时，应做多点校准，并按其线形选择不同的曲线方程进行拟和，如双曲线、抛物线、幂函数、指数函数、对数函数等方程。多数生化分析仪已设置数种曲线方程，可将多点校准的结果自动进行数据处理，得到曲线拟合方程，样本的检测结果便可通过此方程计算。
3．校准品 校准品(calibration material)或校准物，是含有已知量的待测物，用以校准检测系统的测定值。它与分析方法及试剂、仪器相关联。校准品的作用是为了给检测结果赋值，并减少或消除仪器、试剂等造成的系统误差。20世纪50年代都用标准液（标准品）来校准，忽视了标本和标准液有完全不同的基质状态，使用标准液会产生基质效应（检体中的非测定物质对测定量的影响，使检测结果偏离真值），后来采用人血清基质制备的校准品，以减少基质效应造成的误差。在实际工作中要注意，不能用定值质控血清代替校准品用于校准，因为质控血清的定值远达不到校准品的要求。校准品具有专用性，它只能专用于指定的检测系统，如果用于其他检测系统，将会严重影响检验质量，使患者样本的检测结果不可靠，更不具有溯源性。目前临床对校准品专用性认识不足，所以校准品乱用现象十分普遍。对于自建检测系统的校准，最实用的方法是利用患者新鲜样本(其实是最佳校准品)和方法学比较为基础，实现标准转移，或者在自建检测系统校准后，将某批号校准品重新定值，然后用新靶值来做此检测系统的校准。
4．酶活性测定的校准 以往临床上血清酶的测定广泛使用连续监测法、通过理论K值或实测K值计算酶活性。此方法具有快速、低成本等优点，但其最大的问题就是各实验室采用的检测系统不同，使酶活性测定的室间变异明显大于其他项目。为解决此问题，国际临床化学委员会(IFCC)先后提出了两种解决方案：①推荐统一的测定方法即标准检测系统；②用校准品对各检测系统进行统一校准。但酶的测定尚未建立标准检测系统，IFCC提出使用公认的酶校准品来校准实验室的检测系统，采用校准K值计算样本中的酶活性，使血清酶测定结果更具有可比性。
目前采用人血清基质的二级校准品(有证参考物质，CRM)产量低，价格昂贵，只适合作为基准和研究用，一些厂家已研发出可溯源到CRM的临床校准品。在酶的检测中更要强调校准品的专一性，不同的检测系统的酶校准品不能混用。
二、检测系统主要的性能指标
一般来说，评价检测系统的性能即是评价生化分析仪的性能。当前，生化分析仪的生产厂商很多，规格和型号也很多，评价与合理选用这些仪器就显得格外重要。常用评价自动生化分析仪性能的指标是精密度和准确度、分析速度、实用性等。
1．准确度和精密度 影响检测结果精密度和准确度的因素很多，除了环境和人为因素，主要与生化分析仪的硬件性能密切相关，各部件的精密度是准确度的前提，如取液系统的计量是否精准、反应温度控制是否稳定、光源的强度和稳定性是否得到保证等。样品针、试剂针、搅拌棒和反应杯的交叉污染是影响准确度和精密度的重要因素，清洗装置的冲洗效果也决定了分析仪的精密度和准确度。另外，仪器正确的参数设置、合理的校准方案也是保证精密度和准确度的必要条件。
2．分析速度 分析速度是指1小时内完成的测试数(所有已测定样本的项目数之和)，用tests／h来表示。分析速度与加样周期、测试循环周期和反应盘的大小有关。不同分析仪的分析速度可相差甚远。分析速度主要由加样周期和测试循环决定。
(1)加样周期：加样周期(sampling cycle)是指从样品针采集前一个样本开始到采集下一个样本开始所需的时间，加试剂周期与加样周期相应。加样周期决定了分析仪的工作速度，加样周期越短，分析速度越快。单针加样的分析仪，如加样周期为10秒，理论上每小时可取样360次，则其工作速度为360tests／h；若加样周期为4．5秒，则理论工作速度为800tests／h。采用双针加样、双圈反应盘的分析仪有两套阵列式光电检测器，能进行内、外圈反应杯同时加样。目前单个分析单元的常规项目理论测试速度已达到2000tests／h。
(2)测试循环周期：测试循环是指反应杯从前一次使用开始到下一次使用开始所需的时间，与待测物和试剂的总反应时间有关，总反应时间越短，分析速度越快。
3．实用性 生化分析仪实用性必须考虑几个方面：①检测能力，如分析仪能开展的检测项目的类型、通道数、开放程度、试剂瓶容量、批处理样本数、单色光个数；②便捷性，如最小加样量和比色杯最小反应液量越小则受检者的采血量越小，样本预稀释、急诊检验、复查功能等使操作变得方便，还要考虑程序软件的操作是否灵活、方便；③检测成本，如耗材消耗量、光源灯和比色杯寿命、用水量等，都是用户应该综合考虑的内容。
第五节 自动生化分析仪的操作流程
自动生化分析仪完成安装、参数设置、调试和评价后，即能用于临床检测。其日常操作由实验室制定的仪器标准操作规程(standard operate protocol，SOP)进行规定，操作人员必须熟悉仪器性能，严格按照SOP文件规范操
本文作者：...共分享92篇相关文档
